中国黄牛重组PrP^c成熟蛋白单克隆抗体的研制

将纯化的牛重组PrPc 成熟蛋白免疫PrPc 基因敲除小鼠 (PrPc-nullmice) ,利用淋巴细胞杂交瘤技术 ,经一次融合 ,共筛选出3株能稳定分泌针对中国黄牛PrPc 成熟蛋白特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株4D5、5C10和3F3。免疫印迹试验表明 :腹水单抗4D5、5C10和3F3均可特异识别重组中国黄牛PrPc

中国黄牛PrP^c成熟蛋白基因的克隆和序列分析

根据已发表的牛PrPc蛋白基因序列 ,设计合成一对引物 ,并在2个引物的两端分别加入BamHI和NdeI酶切位点。以从中国黄牛肝脏中提取的基因组DNA为模板 ,经PCR扩增出一约640bp的目的基因片段 ,将此基因克隆于 pET11a载体 ,构建了PrPc蛋白基因重组质粒b-pET11a -PrPc ,转化DH -5α并进行序列测定。同源性分析表明 :中国黄牛PrPc成熟蛋白基因与目前国外发表牛的成熟蛋白PrPc基因相比 ,有较大差异 ,发现了一个新的NdeI酶切位点 ;推导的氨基酸序列有4个氨基酸差异 。

中国黄牛PrP^c成熟蛋白的原核表达和抗原性分析

将中国黄牛PrPc 成熟蛋白基因重组质粒b -pET11a -PrPc(本室构建 )转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达。SDS -PAGE电泳显示表达产物的分子量约为23KD ,大小与预计相符 ;免疫印迹 (WesternBlotting)试验进一步证实 ,中国黄牛PrPc 成熟蛋白获得了正确的表达 ,且与大肠杆菌BL21(DE3)