ChlR1蛋白直接与HPV16 E2相互作用并增强E2依赖性DNA复制

为探讨HPV16 E2和ChlR1的相互作用,阐明HPV基因组在复制过程中两个蛋白因子间的调控机制,本研究通过先构建HPV16 E2蛋白和带有血凝素(HA)标签的ChlR1蛋白的C33a细胞表达系统,利用免疫共沉淀分析蛋白间相互作用;通过双胸腺嘧啶阻断使细胞同步化,借助免疫荧光和流式细胞术分析ChlR1和E2的亚细胞定位,与细胞周期和DNA复制起点Ori间的相关性,以及Mre11和Nbs1与E2间的共定位;通过qPCR定量不同浓度梯度HA-ChlR1与HPV16 E2共转染条件下p160OriM的复制情况。免疫共沉淀结果显示,ChlR1是E2蛋白的直接靶向效应因子,并能形成复合物;E2表达使ChlR1从细胞核周围向核内积累。流式细胞术检测结果表明,E2和ChlR1在整个病毒感染周期内共定位,并在S期中期达到峰值;同时,HPV16 E2表达质粒转染的C33a细胞中,观察到明显的E2-NBS1和E2-MRE11共定位。而当Ori存在时,内源性ChlR1与E1/E2共定位,表明ChlR1可能被募集参与病毒DNA复制。此外,qPCR定量分析结果显示,ChlR1过表达明显增强了HPV E2依赖性DNA复制(p<0.001)。HPV E2通过靶向ChlR1蛋白,介导Mre11/Nbs1 DNA损伤应答复合物募集到HPV复制起点,以促进病毒基因组复制。本试验结果为研究HPV新型抑制剂提供思路。