栉孔扇贝♀×华贵栉孔扇贝♂受精及早期胚胎发育过程的细胞学荧光显微观察

为探讨贝类杂交优势 ,利用HOECHST3 3 2 5 8对已固定样品进行染色的方法 ,连续观察了栉孔扇贝♀×华贵栉孔扇贝♂受精的细胞生物学过程 ,初步证明了这 2种远缘扇贝种类之间进行杂交的可行性。结果表明 ,栉孔扇贝的成熟未受精卵子处于第一次减数分裂中前期 ,部分来自华贵栉孔扇贝的异源精子可顺利进入卵子并激发后者完成 2次减数分裂 ,排出第一及第二极体。成熟的雌雄原核形成后完成融合过程 ,形成合子核 ,受精过程结束。大部分杂交受精卵及杂种早期胚胎可以正常发育 ,但其发育进程较种内近交对照组有明显的差别 ,具体表现在延缓性和不同步性 2个方面。

虾夷扇贝精子的冷冻保存及其杂交试验应用研究

以精子活力和受精率为参数,就收集精子的方法、抗冻剂的种类和浓度及冷冻程序和平衡时间对虾夷扇贝精子超低温保存效果的影响进行了研究,并进行了冻存精子与栉孔扇贝卵子的杂交实验.结果表明,肾管处收集到的精液与海水配的16%DMSO 1∶3（v/v）混合,在4 ℃冰箱内平衡5～10 min,在液氮面上方20cm、3 cm处分别停留3 min、10 min后浸入液氮保存,冻精活力在40%以上.在液氮中保存1 d、8 d、30 d、90 d后解冻,冷冻精子活力没有显著差异（P＞0.05）,但明显低于新鲜精子的精子活力.虾夷扇贝的冻精可以使栉孔扇贝卵子受精,受精率在20%以上,并能得到正常的D型幼虫.

栉孔扇贝精子的超低温保存研究

于 1999年 5～ 6月对栉孔扇贝精子进行超低温保存研究。结果表明 ,抗冻液为 DMSO5% +蔗糖 5%并以 2 0℃ / min的降温速率通过 0～ - 80℃时的保存效果最好 ,冻精的活力、受精率、孵化率分别为 4 9.39%、4 2 .0 6 %和 12 .15%。样品体积会对超低温保存效果产生影响 ,体积为 0 .6 ml或 1ml比较适宜。此外 ,在 0℃进行预处理平衡是必须的 ,但时间不宜太长。冻精用 35℃水浴解冻效果最佳 ,50℃次之 ,2 0℃最差。对精子产生冻伤的温域在 - 30～ - 6 0℃之间 ,必须以适当降温速率越过该范围 。

两种颜色栉孔扇贝卵及其早期胚胎磷脂和核酸含量的比较

用钼蓝比色法和紫外分光光度法分别测定栉孔扇贝（Chlamys farrPri）两种颜色的卵子及其早期胚胎中磷脂含量和核酸含量，并进行比较。结果表明，橘红色卵子的RNA含量较浅黄色的略高，而两种颜色卵子的DNA含量却非常相似；在2细胞期，高受精率的受精卵其RNA量迅速增加，DNA和磷脂含量变化不大，但低受精率的受精卵相对未受精卵而言，其DNA、RNA和磷脂含量略有降低；在32～64细胞期，受精率高的胚胎中DNA和磷脂含量增加幅度大，RNA基本保持恒定。磷脂含量与卵子或胚胎的颜色可能有关，核酸、磷脂含量的变化与受精率高低有关。本实验旨为鉴定扇贝卵子的质量提供了科学依据。

栉孔扇贝胚胎超低温液氮保存

选用两种低温保护剂配方，Ａ；１０％甘油＋４％葡萄糖；Ｂ：１５％ＤＭＳＯ（二甲 基亚铜）＋４％葡萄糖＋２％柠檬酸盐，利用微机控制生物降温仪，对栉孔扇贝胚胎 进行液氮低温保存。以１℃／ｍｉｎ由室温降温至－２０℃，接着以２０℃／ｍｉｎ降温至－ ８０℃，然后样品直接入液氮保存（－１９６℃），１周后，经４５℃水浴解冻，栉孔扇贝胚 胎（发育 ６ｄ）的存活率达 ６５． １％（Ａ配方）和 ５６． ６％（Ｂ配方）；而采用６℃／ｍｉｎ降温 至－２０℃，并以 ２０℃／ｍｉｎ降温至－８０℃，直接入液氮，胚胎解冻后的存活率分别为 ３９．０％（Ａ配方）和２７．９％（Ｂ配方）。选用发育２４ｈ的栉孔扇贝胚胎进行液氮保存 实验，解冻后，胚胎基本死亡。

电刺激诱导栉孔扇贝雌核发育的相关参数的筛选

电刺激可诱导卵子雌核发育,但在海洋生物中尚无报道。为获得电刺激诱导栉孔扇贝雌核发育的最佳条件,采用正交设计的方法,分别研究了电场强度、电容、脉冲次数、卵子密度及缓冲液种类对诱导效果的影响。结果表明:(1)不同缓冲液的诱导效果差异不显著(P>0.05),但甘露醇缓冲液的诱导效果优于Zimmerman氏缓冲液和山梨醇缓冲液;最佳卵子密度为11.25×104个/mL,场强的最适范围为1.00～1.75kV/cm。最优电刺激诱导条件组合是:0.30mol/L甘露醇缓冲液,卵子密度11.25×104个/mL,脉冲强度1.20kV/cm,电容3μF,2次电脉冲。(2)应用优化后的电刺激参数诱导雌核发育,获得了最佳的诱导效果,得到的卵裂率为28.16%,胚胎存活率为98.37%。本研究首次成功应用电刺激法诱导了栉孔扇贝的雌核发育,并得到了单倍体胚胎,初步建立了栉孔扇贝中该诱导法的参数体系。

栉孔扇贝胚胎和幼虫中的17β-HSD8表达分析

17β-羟类固醇脱氢酶8(17β-HSD8)广泛分布在脊椎动物体内的多种组织中,调节类固醇激素代谢和脂肪酸代谢。本文采用荧光定量RT-PCR和原位杂交技术,对栉孔扇贝胚胎和幼虫中17β-HSD8mRNA的时空表达进行了分析。研究结果表明,栉孔扇贝17β-HSD8在未受精卵中高水平表达,受精卵和卵裂期胚胎中表达量显著下降,囊胚中的表达量显著提高。提示栉孔扇贝17β-HSD8是一个母源表达的基因,其合子基因在囊胚时期开始表达。原位杂交结果显示,17β-HSD8mRNA阳性信号在各发育阶段的胚胎和担轮幼虫中均匀分布,在D形幼虫中主要定位在内脏团附近,提示17β-HSD8可能参与起始器官发生。