两种珍稀白蝶兰属(兰科)叶绿体基因组比较分析

为理解珍稀濒危兰科植物龙头兰(Pecteilis susannae)和景洪白蝶兰(P.hawkesiana)的叶绿体基因组的基本特征,开发用于物种鉴定、保护遗传学和系统发育分析的分子标记,该研究利用二代测序技术对龙头兰和景洪白蝶兰进行浅层基因组测序,采用生物信息学分析方法进行叶绿体基因组的拼接、组装和注释,并与其他近缘物种进行比较基因组分析和系统发育分析。结果表明:(1)龙头兰和景洪白蝶兰的叶绿体基因组大小分别为154 407 bp和153 891 bp,由一对26 550 bp和26 523 bp的反向重复序列(IR)、84 204 bp和83 756 bp的大单拷贝区(LSC)、17 103 bp和17 089 bp的小单拷贝区(SSC)组成;均注释了111个唯一基因,包括77个蛋白质编码基因、30个tRNA基因和4个rRNA基因。(2)在叶绿体基因组中分别鉴定出94个和92个简单重复序列(SSRs)。(3)二者之间存在706个单核苷酸多态性(SNPs)位点和152个插入缺失(InDels)位点,其中cpInDel 067等可以区分2个物种。(4)观察到1个差异较大的基因(accD)和9个高变区(rps19-psbA、matK-trnQ-UUG、psbM-psbD、trnT-UGU-ndhJ、accD-psaI、ycf4-cemA、clpP-psbB、ndhF-trnL-UAG、rps15-ycf1)。(5)系统发育分析结果显示,龙头兰、景洪白蝶兰和鹅毛玉凤花(Habenaria dentata)的亲缘关系较近。在白蝶兰属2种叶绿体基因组研究中获得的SSR位点、InDels和高变区序列可为物种鉴定、开发利用及其资源保护提供有价值的遗传信息。

4种金花茶叶绿体基因组比较分析

利用全基因组重测序数据组装得到了夏石金花茶等4种金花茶的叶绿体全基因组序列,并进行了注释和比较分析.结果表明,4种金花茶植物叶绿体基因组序列高度相似,约为156657~157046 bp,均预测注释134个基因,包含89个蛋白编码基因、8个rRNA和37个tRNA;金花茶植物的叶绿体基因组在结构和进化上具有保守性,它们具有相似的密码子偏好性且均未发生大面积的倒位和基因重排;通过叶绿体基因组的比较分析和核苷酸多态性分析发掘了rps16和ycf1等高变异片段,这些片段可作为金花茶植物的分子标记;基于金花茶叶绿体基因组数据构建的系统进化树具有较高的支持度,说明金花茶叶绿体基因组序列的公布对其系统发育的研究具有重要意义.

普通油茶与小果油茶的叶绿体基因分子鉴定标记

[目的]开发能够准确、便捷、快速鉴定普通油茶与小果油茶的叶绿体基因分子标记,为油茶遗传资源的挖掘与利用提供参考。[方法]基于高通量测序技术组装了普通油茶和小果油茶的叶绿体全基因组,通过比较基因组学技术寻找两者叶绿体全基因组的差异,并根据其差异来开发可用于鉴定普通油茶与小果油茶的分子标记。为验证标记的有效性,分别选取具有代表性的12个普通油茶居群和6个小果油茶居群的个体,提取叶绿体全基因组,进行PCR扩增和凝胶电泳检验。[结果]组装的普通油茶与小果油茶叶绿体基因组序列全长分别为156 977、156 539 bp,两者叶绿体全基因组具有高度的保守性,但小果油茶在atpH基因与atpI基因间的非编码区存在长度为452 bp的大片段缺失。所开发引物的PCR扩增结果表明,所有普通油茶样本均可扩增出609 bp的条带,而小果油茶扩增出227 bp的条带,条带差异显著且稳定。[结论]使用所开发的分子标记能够稳定、便捷、精确地鉴定出普通油茶与小果油茶,但是使用时应先确定所鉴定的物种为普通油茶和小果油茶中的一种。

叶绿体微卫星在植物种质资源研究中的应用

叶绿体微卫星(chloroplastsimplesequencerepeat,cpSSR)是近年来发展起来的一种新型高效的分子标记技术,由于具有微卫星标记共显性、高多态性、分布广泛性等优点又兼顾到叶绿体基因组结构简单、相对保守、单亲遗传等特点,目前广泛用于植物群体遗传分析及系统发育分析研究,在更高分类水平和自然植物群体间基因漂移研究上特别有用。本文就cpSSR分析技术的原理、特点、引物开发等方面进行了介绍,并针对其在群体遗传结构、基因流动进化、物种演化、胞质遗传特性、种群分类等方面的研究进展进行了综述,并据此提出问题和展望。

非AA型野生稻叶绿体DNA籼粳特性研究

籼粳分化现象广泛存在于亚洲栽培稻(O.sativa)中。大量研究表明,普通野生稻(O.rufipogon)的叶绿体DNA也存在籼粳分化。为进一步探明非AA型野生稻的叶绿体DNA是否存在籼粳分化现象,利用2个长度多态性籼粳分型标记(ORF100和ORF29-TrnCGCA)对12个非AA型野生稻种的叶绿体DNA进行籼粳特性分析。研究发现,非AA型野生稻叶绿体DNA都呈现偏粳趋势。对叶绿体DNA碱基多态性最丰富的2个区域(rps16基因内含子和TrnTUGU-TrnLUAA间区)进行测序比较,在4个位点的籼粳分型标记中,非AA型野生稻有3个位点与粳型标记一致,1个位点与籼型标记一致,但另有多个位点的碱基与栽培稻不同。研究结果表明,非AA型野生稻叶绿体DNA总体偏粳,但与典型粳稻存在一定遗传差异。推测粳型叶绿体可能为稻属原始类型。

叶绿体DNA分析技术及其在栗属植物中的应用

被子植物叶绿体DNA母性遗传,有独立的进化路线,基于叶绿体DNA的分析技术在分子系统学、资源多样性评价、杂种鉴定等方面具有重要作用。栗属植物资源丰富,分布广泛。概述了叶绿体DNA分析技术在栗属植物中的研究进展,阐述了包括PCR-RFLP、DNA杂交、叶绿体SSR标记技术和叶绿体基因区段测序分析技术在内的分子标记技术的原理、特点及其在栗属植物中的应用。并对今后如何开发叶绿体DNA标记用于栗属植物的研究进行了展望。

温敏核不育系株1S籼粳的属性研究

温敏核不育系株1S是生产上广泛应用的水稻优良早籼型不育系品种。以典型籼稻和粳稻为对照,采用ISSR、SRAP和TRAP三种分子标记方法对株1S核DNA进行分子遗传学分析。结果表明,株1S核DNA以籼型基因为主,但含有部分粳型特异性片段,具有一定的粳型血缘;3种分子标记方法都能建立株1S所特有的分子指纹。对株1S叶绿体DNA中ORF100、ORF29-TrnCGCA、TrnTUGU–TrnLUAA、rps16基因内含子等序列分析表明,株1S为籼型叶绿体,对照材料培矮64S、准S为粳型叶绿体;株1S在TrnTUGU–TrnLUAA片段中存在2个特异碱基。利用籼型细胞质和含有适量粳稻血缘的两用核不育系可能是长江中下游双季稻区高产稳产早稻组合的育种途径。

江淮流域杂草稻叶绿体DNA的籼粳分化

为了探明江淮流域杂草稻的细胞质来源,根据水稻叶绿体DNA ORF100(Open Reading Frame 100)序列在籼粳间存在69 bp差异的特征,设计了InDel标记cpDNA69。利用该标记对2个分别以籼稻和粳稻为母本的F2群体、22份栽培稻(Oryza sativaL.)、3份普通野生稻(O.rufipogonGriff.)进行了分析验证。PCR结果可以获得缺失和非缺失两种带型,缺失带型与以籼稻为母本的F2群体、10份籼稻材料完全对应;非缺失带型与以粳稻为母本的F2群体、11份粳稻材料完全对应,3份广西普通野生稻为非缺失带型,属粳型,1份以粳稻为母本的籼粳杂交材料为粳型。因此,cpDNA69可以用作叶绿体籼粳鉴定标记。利用该标记对22份杂草稻的叶绿体DNA鉴定的结果表明,7份早年发现的杂草稻,即江苏省连云港穭稻和安徽省怀远、来安、全椒、肥东的塘稻的叶绿体DNA为非缺失带型,属粳型,而近年来在江苏省扬中、高邮、灌云、洪泽、盐都、兴化、如皋等地直播稻田发现的15份红米杂草稻的叶绿体DNA为缺失带型,属籼型。这为进一步研究江淮流域杂草稻的来源提供了依据。

柑橘体细胞胞质遗传及叶绿体SSR引物开发

以38个组合的柑橘体细胞杂种（或胞质杂种）为试验材料,综合应用RFLP、CAPS和cpSSR分子标记技术,对这些杂种的线粒体和叶绿体遗传组成进行了分析;同时对试验技术体系进行了完善与拓展,开发了柑橘叶绿体SSR标记;并对柑橘愈伤组织长期继代保存过程中胞质基因组遗传变异进行了分析,主要结果如下：

基于基因组数据库的杂草稻叶绿体分子标记开发

[目的]杂草稻的起源与演化是一个未澄清的热点问题,分子标记技术是最重要的研究手段之一。由于已经应用的分子标记数量有限,与栽培水稻缺乏特异性,因此探索新的分子标记仍然十分必要。[方法]使用网络基因组数据库中13份栽培水稻和野生稻叶绿体全基因组序列进行比对和分析,针对其中的高频变异区域设计标记引物,进而对60份杂草稻样品的标记区域测序并进行多态性验证。[结果]13份样品叶绿体全基因组中存在1020个单核苷酸多态性(SNP)位点,111个插入/缺失(InDel)位点,表现出丰富的遗传变异;选定其中3个高频变异区域,分别针对trnG-trnfM基因间区、psbM-trnC基因间区和trnT-trnL基因间区设计了3对引物,对60份杂草稻材料进行了检测,发现3个片段总长1966bp,共存在7个SNP位点,6个InDel位点,总变异序列长度为34bp,占序列总长的1.73%。系统发育树结果显示,60份杂草稻被划分为4个类群。另外,将网络数据库中的13份栽培水稻和野生稻数据进行分析,发现不同栽培稻和野生稻的籼粳类型分别被聚到杂草稻的相应类群中。[结论]所开发的3对叶绿体分子标记可以对上述杂草稻进行良好的分类,因此可以作为研究杂草稻遗传多样性及演化的分子标记。

木芙蓉三个品种及近缘种的叶绿体基因组比较分析

木芙蓉(Hibiscus mutabilis)栽培历史悠久,是原产中国的古老园林树种和药用植物。为了探讨木芙蓉品种及近缘种的进化特征,厘清木芙蓉品种间及其与近缘种间的亲缘关系,以及探究木芙蓉叶绿体基因组(chloroplast DNA,cpDNA)的遗传方式,该文选择了一个杂交组合中的3个木芙蓉栽培品种(‘单瓣白’‘金秋颂’‘牡丹粉’),用高通量测序平台Illumina NovaSeq对其cpDNA进行首次测序。经组装注释后得到3条完整的cpDNA序列,结合该团队已经完成的近缘种台湾芙蓉(H.taiwanensis)和来自基因库的木槿、朱槿的cpDNA,对木槿属4种及木芙蓉种下的3个品种进行了cpDNA组成和结构特征的比较分析,并完成了其系统发育树重建。结果表明:(1)‘单瓣白’‘金秋颂’‘牡丹粉’的cpDNA序列长度分别为160880、160879、160920 bp,基因数目均为130个,其中蛋白编码基因85个、核糖体RNA 8个和转运RNA 37个。(2)比较分析结果显示,木芙蓉的种下3个品种及其近缘种台湾芙蓉在cpDNA上高度保守,反向重复区(IR)均为26300 bp;木槿和朱槿在IR区发生了收缩,分别为25745、25598 bp。(3)系统发育分析结果显示,种下3个品种先聚成一个单系支,再与台湾芙蓉聚成一个高支持率分支,表明木芙蓉和台湾芙蓉的亲缘关系最近;相较于木槿和朱槿,木芙蓉、台湾芙蓉2种与海滨木槿、黄槿、大麻槿在亲缘关系上更近。(4)木芙蓉3个品种之间能通过cpDNA序列区分开,在大/小单拷贝区(LSC/SSC)长度上,‘单瓣白’‘金秋颂’‘牡丹粉’分别为89355 bp/18925 bp、89353 bp/18926 bp、89400 bp/18920 bp,并且从重复序列和核苷酸多样性分析中开发出了候选分子标记和DNA条形码,可以作为品种鉴定的分子条码。(5)木芙蓉品种‘单瓣白’与‘金秋颂’cpDNA差异最小,亲缘关系最近,根据两者母本与子代的关系,证明了木芙蓉cpDNA的母系遗传特征。该研究结果有助于更好地了解3个木芙蓉品种及台湾芙蓉cpDNA的进化特征和物种间的系统发育关系,为木芙蓉品种的准确鉴定和优良品种选育提供了cpDNA方面的基础资料。

菝葜叶绿体基因组的组装分析与分子标记研究

目的采用高通量测序数据和新组装手段对药用植物菝葜的叶绿体基因组进行精细组装,并以此为基础厘清其分类地位,开发分子鉴定标记。方法利用两种测序手段重新测定并精细组装菝葜叶绿体基因组;重建菝葜近缘物种在时间尺度下的系统发育关系;分析菝葜叶绿体基因组一级结构并检测编码区选择压力;筛选并验证具备种群特异性的SSR引物。结果混合组装结果显示菝葜叶绿体基因组全长157959 bp,内含编码基因86个。菝葜族与油点草族和百合族互为姐妹群;其内部约26.5Mya开始出现分化。在accD、rbcL及rpl20基因中存正选择信号。247个SSR位点中的3个具备作为菝葜分子鉴定标记的潜力。结论利用短读长和长读长共同组装菝葜叶绿体基因组的结果更佳。已探明的3个SSR位点能为筛选分子标记提供数据支撑。

茶树叶绿体基因组SNP分子标记的初步研究

传统的叶绿体基因分子标记在茶组植物分类系统研究中的应用价值相对有限,为了筛选可用于茶树鉴别与母系溯源的SNP(单核苷酸多态性)位点组合,将18个已报道的茶组植物叶绿体全基因组序列进行比对,通过设计通用引物,在169个茶树品种/品系中进行候选分子标记扩增与一代测序分析,筛选出16对引物,共含25个SNP位点可用于茶树品种母系溯源与鉴别分析。另外,将SNP位点组成的DNA指纹图谱结合茶树品种资源基本信息进行数字编码,最终形成由30位数字组成的茶树品种资源分子身份证,并构建相应的条形码和二维码用于品种识别。本研究数据为茶树品种的母本溯源与鉴别提供新的思路。

蒙古莸叶绿体基因组微卫星位点分析及引物筛选

本研究旨在为蒙古莸在分子水平上提供理论依据,以便对濒危稀有种制定科学的保护策略。本研究下载GenBank数据库公布的蒙古莸叶绿体基因组信息,利用生物信息学对蒙古莸叶绿体基因组进行cpSSR分析。利用MISA软件全面搜索蒙古莸叶绿体基因组SSR分子标记,并对其分析;运用Primer Premier 3.0设计并筛选多态性较好的引物用于后续研究。在全长151 707 bp的蒙古莸叶绿体基因组中,共鉴定出31个cpSSR位点,位点间平均分布距离为4 893.77 bp,其中以单核苷酸重复为主,且主要分布于LSC区,占SSR位点总数的74.19%;其次是四核苷酸重复,分布于LSC及SSC两区,占SSR位点总数的19.35%,分布最少为三核苷酸,仅占总位点数的3.23%。将所有31个位点合成31对叶绿体微卫星引物,通过毛细管电泳检测,最终筛选出8对多态性引物。此外,挑选多态性好的马鞭草EST-SSR引物,扩增结果产生非特异性条带,且与马鞭草扩增片段范围相差较大。基于软件的参数设置,单核苷酸重复数量占比最多,三核苷酸重复占比最少;从31对引物筛选出8对多态性引物,扩增率达100%,多态率为26%;此外,马鞭草与蒙古莸的扩增条带范围相差较大,说明二者有较大差异的遗传背景。在此基础上,本研究为后续蒙古莸的种质鉴定、系统发育、群体遗传进化分析提供理论依据。

基于叶绿体SSR分子标记的苦参种质资源遗传多样性分析

以来自15个不同产地的150份苦参为材料,采用cpSSR分子标记技术探究不同产地苦参种质资源的遗传多样性。结果表明,18对cpSSR引物共扩增出311个条带,检测出97.47个等位基因,平均每对cpSSR引物扩增出17.28个条带。平均检测到的等位基因数(Na)为5.415,有效等位基因数(Ne)为4.395,Shannon's信息指数(I)为1.535,多样性指数(h)为0.748,无偏多样性指数(uh)为0.832,多态信息含量(PIC)为0.886,PIC>0.5说明18对cpSSR引物具有较高的多态性。不同产地的苦参遗传多样性丰富,其中山西武乡土河坪种质(THP)的I为1.600,Ne为4.786,其他遗传多样性指数均较大,是遗传多样性较丰富的苦参产地。居群分子方差分析(AMOVA)表明,苦参种质内个体间差异大,苦参种质内遗传变异率大于种质间的。聚类分析、主坐标分析(PCoA)和STRUCTURE软件进行的遗传结构分析结果均将不同产地的苦参分为2个类群,并且分类结果有明显的地理相关性。第1类群中的9个苦参种质主要来自山西、河北、陕西和内蒙古等地,第2类群主要来自山东、河南、江苏以及安徽等地。18对cpSSR引物在苦参内具有很好的适用性。苦参种质资源的遗传多样性研究为发掘、利用与保护苦参种质资源以及优良品种的选育提供一定的理论基础。

野生大麻叶绿体基因组分子多态标记的筛选与开发

以6份不同生态区野生大麻为试验材料,对叶绿体17个高变区的通用引物进行多态性筛选,同时基于已公布的大麻叶绿体基因组全序列,应用生物信息学软件对其进行比较基因组学分析,开发新的多态性引物。结果显示:(1)17对通用引物,通用性达76.5%,但仅ndh F-rpl32引物产物多态性好;(2)比较基因组学研究表明大麻叶绿体基因组多态性比较低,但存在极少的高变区,针对全序列高变区段设计的4对引物(trn L-rpl32~a,rps8-rps11,psa I-acc D,rps16~a)在6份野生大麻群体材料中分别有2~8个变异位点,具有较高的多态性。叶绿体非编码基因片段通用引物ndh F-rpl32及本研究针对大麻开发的trn L-rpl32~a、rps8-rps11、psa I-acc D、rps16~a引物在大麻中具有专一性强、产物多态性高等特点,可作为高效分子标记应用于大麻种质资源遗传多样性与保护、物种起源与遗传进化、种下分类鉴定、工业大麻育种等研究。

药食两用藠头叶绿体基因组解析、比较基因组学及系统发育研究

藠头(Allium chinense)为百合科葱属常用药食两用植物。为探究部分葱属植物系统发育关系不明确及该属物种鉴别通用DNA条形码匮乏的问题,本研究应用高通量测序技术对藠头叶绿体全基因组进行测序、组装、注释及系统进化研究。结果显示藠头叶绿体基因组为152 525 bp,呈典型的四分状结构,共编码116个基因,其中蛋白质编码基因81个,转运RNA (transfer RNA)基因31个和核糖体RNA (ribosome RNA)基因4个。对6个葱属植物叶绿体基因组比较分析发现了7个变异较大的区间,包括基因编码区ndhA和ycf1,以及非编码区rps16-trnQ、trnT-trnF、ndhF-rpl32、rpl32-trnL和rpl16-rps3。利用葱属和非葱属53个物种的58个共有蛋白序列构建了进化树,发现除百合属、重楼属外其余各属物种所在分枝的支持率都达到66%～100%,有效地解决该类植物的系统进化与分类问题。此外,利用EcoPrimer软件成功发现了7个可用于葱属物种鉴定的候选DNA条形码序列并设计了引物。本研究首次获得了藠头叶绿体基因组序列,明确葱属物种间的亲缘关系,发现了一系列葱属物种特异的DNA条形码序列,为深入研究葱属植物的系统进化、分类及物种鉴定提供科学依据。

密花香薷叶绿体基因组结构及系统进化分析

目的基于高通量测序获得药用资源植物密花香薷Elsholtzia densa叶绿体基因组序列,分析了叶绿体基因组结构及特征,为研究密花香薷资源分类及系统进化奠定了基础。方法以密花香薷叶片为材料,利用改良的CTAB法提取DNA;采用二代测序技术Illumina NovaSeq平台对叶绿体基因组进行测序;以广藿香叶绿体基因组为参考序列,进行序列组装和矫正,得到完整叶绿体基因组序列;利用生物信息学方法分析密花香薷叶绿体基因组特征并进行系统发育分析。结果获得密花香薷完整叶绿体基因组序列全长149095bp,GC含量37.92%,注释到130个基因,其中包括85个蛋白质编码基因,8个rRNA基因和37个tRNA基因;密花香薷叶绿体基因组中共检测到28个散在重复序列,串联重复序列共检测到191个,单核苷酸重复序列最多,共114个;系统发育结果表明,密花香薷和其他唇形科植物聚合在一起形成一个分支结构,紫苏属植物和香薷属植物亲缘关系较近。结论建立了适于香薷属植物叶绿体基因组测序及其特征分析的方法,丰富了唇形科植物遗传资源,为密花香薷分子标记开发及唇形科属种间系统发育分析研究提供了理论基础。

大花韭和粗根韭叶绿体全基因组的结构特征和遗传标记

大花韭(Allium macranthum)和粗根韭(A. fasciculatum)是两个葱属特有的高山姊妹物种。本研究通过叶绿体基因组的比较分析,揭示重复序列和潜在的插入序列,并筛选遗传标记用于开发物种鉴定的候选条形码,探究该属物种的系统发育规律。研究结果表明:大花韭和粗根韭完整的叶绿体基因组是一个典型的四分体结构,基因组大小分别为152 148和152 931 bp,显示出高度的相似性。其基因ccsA、clpP、rpl14、rpoC2、rps8、atpF、cemA、matK、rpoA和rps4与低海拔的葱属植物比对,检测到较高的非同义突变(Ka)和同义突变(Ks)的比值。参考茖葱(A. victoralis)的叶绿体基因组序列,比较2个姊妹种发现psbI-rpoC2、accD-psaI、rpl36-rps8、rpl32-ndhD和ccsA-ndhA共5个基因片段具有相对较高的核苷酸多样性;核苷酸多样性分析结果显示,LSC区有11个高度可变的基因,SSC区有5个,但IR区的核苷酸多样性很低(Pi<0.015);在LSC和SSC区观察到3个突变热点,均表现出较高的编码基因核苷酸多样性值(Pi>0.03)。利用11个石蒜科物种的编码基因序列和完整叶绿体基因组构建系统进化树,发现大花韭和粗根韭紧密地聚合在一起,葱属物种都聚成一枝单系类群。本研究报道的2个叶绿体全基因组为葱属的物种鉴定、种间进化研究和重建系统发育提供了研究基础。

含当归中成药的DNA提取及其分子鉴定

目的：优化含当归中成药的DNA提取方法,并利用叶绿体trn L-F基因及当归特异分子标记对当归中成药进行鉴定。方法：采用传统十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法,十二烷基磺酸钠（SDS）法,磁珠法以及改良CTAB法对10种含有当归成分的中成药进行DNA提取,利用微量紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳检测所得总DNA的完整性、纯度和浓度。对10份当归中成药的trn L-F序列进行扩增、测序,对序列进行比对分析并构建系统发育树。利用当归特异鉴别分子标记对10种当归中成药中的当归成分进行分子鉴别。结果：利用改良CTAB法获得了纯度较高,质量较好的DNA。10种中成药中当归的trn L-F序列与正品当归序列相似度为99.88%-100%,系统发育树显示10份中成药中的当归与正品当归聚为一类。利用当归特异性鉴别分子标记进行验证,10种中成药DNA样品均能得到明亮的扩增条带。结论：改良CTAB法可以有效提取当归中成药中的基因组DNA。利用trn L-F序列和当归特异性鉴别分子标记,成功对10份市售当归中成药进行了分子鉴别,为当归类中成药的分子鉴定奠定了基础。