霍乱毒素B亚基基因上游序列对B亚基表达水平的影响

本研究通过缺失突变和移码突变研究了ｃｔｘＢ基因上游Ａ基因部分序列对ｃｔｘＢ表达水平的影响，结果表明：（１）将霍乱毒素操纵子ＸｂａＩ－ＥｃｏＲＩ片段克隆至ｐＵＣ１９，构建的质粒ｐＵＣ１９ＣＴＢ中Ａ亚基的部分序列不能翻译，该质粒转化大肠杆菌后ＣＴＢ的表达产量为３０μｇ／μｌ；（２）在质粒ｐＵＣ１９ＣＴＢ的ＸｂａＩ位点引入移码突变，构建质位ｐＭＣ０２Ｃ，使Ａ亚基基因部分序列能够翻译至自然的终止密码，Ｂ基因的表达水平却降低一倍；（３）质粒ｐＵＣ１９ＣＴＢ缺失ＸｂａＩ－ＣｌａＩ（５５０ｂｐ）的非翻译序列，构建质粒ｐＭＣ０３（Ａ亚基序列不翻译），该质粒转化大肠杆菌后ｃｔｘＢ基因的表达水平降低１倍；（４）在质粒ｐＭＣ０３中ｃｔｘＢ基因上游引入移码突变，构建质粒ｐＭＣ０３Ｃ，其Ａ亚基部分序列能够表达，这时ＣＴＢ的表达水平较ｐＭＣ０３低得多，较ｐＵＣ１９ＣＴＢ低２０倍以上。进一步研究表明，在ＸｂａＩ－ＣｌａＩ片段之间存在具有较强启动子活性的ＤＮＡ序列是５５０ｂｐ非翻译序列缺失后ＣＴＢ表达水平降低的原因。对Ａ基因的阅读框架变化影响ＣＴＢ表达水平的可能机理进行了讨论。

霍乱毒素B亚基基因上游序列对B亚基表达水平的影响

本研究通过缺失突变和移码突变研究了ctxB基因上游A基因部分序列对ctxB表达水平的影响,结果表明:(1)将ctx操纵子XbaI—EcoRI片段克隆至pUC19,构建的质粒pUC19CTB中A亚基的部分序列不能翻译,该质粒转化大肠杆菌后CTB的表达产量为30μg/ml;(2)在质粒pUC19CTB的XbaI位点引入移码突变,构建质粒pMC02C,这时A亚基的部分序列的阅读框架与lacZ一致,从而A基因能够翻译至自然的终止密码,B基因的表达水平却降低一倍;(3)质粒pUC19CTB缺失XbaI～ClaI(550bp)的非翻译序列,构建质粒pMC03(A亚基序列不翻译),该质粒转化大肠杆菌后ctxB基因的表达水平降低1倍;(4)在质粒pMC03中ctxB基因上游引入移码突变,构建的质粒pMC03C(ctxB上游基因能够表达)CTB的表达水平较pMCO3低得多,较pUC19CTB低20倍以上。对产生上述现象的原因进行了分析讨论。