一氧化氮参与调控油菜素内酯增强高山离子芥悬浮细胞抗寒性

为探究油菜素内酯(BRs)诱导提高植物的抗寒性是否受一氧化氮(NO)信号分子调控,以高山离子芥(Chorispora bungeana)悬浮细胞为材料,分别用24-表油菜素内酯(EBR)、NO供体SNP、NO清除剂PTIO、一氧化氮合成酶(NOS)抑制剂L-NAME、EBR+PTIO以及EBR+L-NAME进行处理,分析在低温胁迫下以上处理对细胞抗寒性、活性氧(ROS)水平以及抗氧化防御系统的影响。结果表明:(1)外源EBR处理可以缓解低温胁迫对悬浮细胞活力的抑制以及离子渗漏和膜脂过氧化程度的加剧,从而增强细胞对低温的抗逆能力。SNP处理对上述生理指标的影响与EBR类似。(2)在低温胁迫下,与EBR处理细胞相比,EBR+PTIO以及EBR+L-NAME处理会导致悬浮细胞活力下降,离子渗漏和膜脂过氧化程度显著升高,表明阻断NO信号会降低EBR诱导提高的抗寒性。(3)与仅受低温胁迫的细胞相比,外源EBR处理导致细胞NO含量和NOS活性进一步升高,而EBR诱导的NO积累可以被PTIO或L-NAME所抑制。(4)EBR、SNP处理均可以明显抑制低温胁迫下离子芥悬浮细胞过氧化氢(H_(2)O_(2))含量、超氧阴离子(O_(2)·^(-))产生速率和羟自由基(OH-)含量的升高,并显著增强抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及增加抗坏血酸(AsA)和还原性谷胱甘肽(GSH)的含量,从而缓解低温造成的氧化损伤,而PTIO、L-NAME会不同程度抑制低温胁迫下EBR的这些保护功能。综上所述,EBR通过激活离子芥悬浮细胞的NOS活性来促进细胞内源NO积累,从而提高其抗寒性。EBR处理可以抑制低温胁迫下ROS过量积累并增强细胞的抗氧化防御能力,这两个过程都受NO信号分子调控,从而缓解低温造成的氧化损伤,防止膜脂过氧化程度加剧,提高细胞对低温胁迫的抗逆性。因此,低温胁迫下,高山离子芥悬浮细胞NOS来源的NO是EBR信号转导的下游信号分子。

高山离子芥CbMAPK3基因克隆与原核表达

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)在信号传导过程中发挥着重要的作用。以高山离子芥叶片为材料,利用RT-PCR法克隆到全长CbMAPK3基因cDNA,将其与大肠杆菌表达载体pET-30a连接,构建原核表达载体pET-30a-CbMAPK3,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE以及Western blot检测结果表明该基因表达了1个约46kD的蛋白,为进一步研究目的蛋白的结构和功能提供了实验基础。

高山离子芥试管苗在PEG-6000模拟干旱条件下的生理响应

以高山离子芥(Chorispora bungeana)为试材,采用固液培养法,设置对照(不添加PEG-6000,CK)、5%PEG-6000、10%PEG-6000、20%PEG-6000、40%PEG-6000五个干旱处理水平,研究了不同浓度PEG-6000模拟干旱环境下,对高山离子芥幼苗生理生化特性的影响。结果表明:干旱胁迫下,随着不同的处理时间,脯氨酸含量始终保持上升的趋势且含量显著高于对照;可溶性蛋白的含量也有波动,呈现先上升后下降的趋势;丙二醛(MDA)含量,随着时间的延长,呈现先升高再下降的趋势且含量显著高于对照。幼苗叶片叶绿素总含量呈现先升高后下降的趋势,在浓度为40%PEG-6000胁迫下,叶绿素总含量均显著低于对照;叶绿素a则有显著降低的趋势;叶绿素b在浓度为5%PEG-6000胁迫下显著升高,在浓度为10%、20%、40%PEG-6000胁迫下也呈现显著升高的趋势;但其含量总体低于叶绿素a;Chla/Chlb的值经历了先升高后下降的趋势且均高于对照。在各浓度及不同时间处理胁迫下,高山离子芥叶片K+、Na+、Ca2+、Mg2+含量有明显波动:K+、Ca2在5%和10%PEG-6000胁迫6、12、24、48、72h后均显著高于对照,而40%PEG-6000胁迫后均显著低于对照。Na+在5%PEG-6000各时间段胁迫后含量较对照有所增加,在其它浓度和时间处理下其含量均低于对照;而Mg2+含量在40%PEG-6000胁迫下虽有下降趋势但均显著高于对照。表明在干旱胁迫下,高山离子芥通过改变渗透调节物、光合系统中叶绿素含量及离子含量等,启动应对外界干旱环境的耐旱响应机制,从生理角度揭示了高山离子芥响应耐旱的生理生态机理。

低温胁迫对高山离子芥试管苗膜脂过氧化及AsA-GSH循环系统的影响

通过研究高山离子芥细胞在不同低温胁迫中活性氧代谢及AsA-GSH循环中生理指标的动态变化,揭示其响应低温胁迫的部分生理机制.以天然抗寒性植物高山离子芥试管苗为材料,研究了脂质过氧化产物,活性氧和抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环系统对其冷冻低温胁迫(4℃、0℃和-4℃)的反应.结果显示低温胁迫下,高山离子芥细胞中相对电导率、丙二醛(MDA)、H2O2含量和GSH不同程度的提高;抗坏血酸过氧化酶(APX)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)及谷胱甘肽还原酶(GR)活性在4℃和0℃胁迫下呈波动性变化,在-4℃胁迫下,APX和MDHAR活性处于抑制状态,显著低于对照(P<0.05),而GR活性则呈现出先升高后降低的变化趋势.结果表明低温胁迫下,高山离子芥试管苗发生不同程度的膜脂过氧化,并可能通过增加细胞内H2O2含量来促进其抗氧化保护能力;同时AsA-GSH循环代谢中抗氧化酶(APX,MDHAR,GR)与抗氧化剂(GSH)共同协调作用,以减轻低温所造成的伤害.

低温胁迫下内源性ROS对磷脂酶D活性影响的研究

低温(4℃,0℃和-4℃)处理高山离子芥(chorispora bungeana),研究低温胁迫引发的内源性ROS对高山离子芥叶中线粒体膜结合态磷脂酶D(Phospholipase D PLD)活性的影响,以期揭示内源性ROS对高山离子芥叶中线粒体膜结合态PLD活性的调控机制。结果表明,在4℃,0℃和-4℃处理下,高山离子芥叶中H2O2的含量和PLD活性均高于空白对照组。在正常条件下,用不同浓度H2O2处理后,PLD活性高于空白对照组。当添加NADPH氧化酶抑制剂(diphenylene iodonium DPI)处理后,在3个温度胁迫下PLD活性低于对照组,在该条件下线粒体膜结合态Ca^(2+)含量高于对照组。当用DPI+CaCl2处理后,PLD活性较添加DPI处理组高,而添加Ca^(2+)的螯合剂EGTA处理后,PLD活性与对照组相比表现出降低,表明低温胁迫下高山离子芥叶中Ca^(2+)参与内源性ROS对PLD活性的调控。

低温胁迫下高山离子芥消减文库的构建

以0℃低温处理12 h的高山离子芥幼苗cDNA为检测子,以正常生长温度下的高山离子芥幼苗cDNA为驱动子,应用抑制性消减杂交技术,构建冰缘植物高山离子芥的消减文库,筛选在低温下高表达的基因片段.随机挑取96个阳性克隆进行测序分析,得到39个独立的基因片段,26个和已知基因有较高的同源性,13个为未知基因.基因分析表明:高山离子芥在低温胁迫下,微丝交联蛋白Actin cross linking protein很可能在感受低温的过程中行使作用,而DREB2A和ABF1协同作用一起调节下游冷响应基因的表达,为进一步研究高山离子芥的抗冻机制奠定了基础.

高山离子芥磷脂酶Dα编码区基因序列克隆与表达载体构建

磷脂酶D(PLD)是重要的细胞磷脂代谢酶,在植物的生长及对不良环境胁迫的抵御反应中起重要作用.本试验以高山离子芥(Chorispora Bungeana)为材料,取幼叶分离mRNA,反转录合成cDNA,PCR扩增加XbaΙ和SacΙ酶切位点的高山离子芥磷脂酶Dα(PLDα)编码区序列、测序.结果表明插入片段为PLDα目的基因片段,全长约1 600bp,blast比对发现该序列与Genbank中报道的拟南芥PLDα基因相比同源率为94.6%.回收纯化PCR产物,克隆至pTG19-T载体双酶切后将目的基因片段定向克隆至pBI-121载体,构建高山离子芥PLDα基因编码区片段的表达载体pBI121-PLDα,双酶切及PCR鉴定结果显示表达载体构建成功,为下一步进行抗逆转基因作物选育奠定了基础.

干旱胁迫对高山离子芥试管苗抗氧化系统及其活性氧代谢的影响

该试验以高山离子芥试管苗(Chorispora bungeana)为试材,采用固液培养法,设置对照(不添加PEG-6000,CK),轻度干旱胁迫(5%PEG-6000)、中度干旱胁迫(20%PEG-6000)、重度干旱胁迫(40%PEG-6000)4个干旱处理水平,分析干旱胁迫对高山离子芥幼苗抗氧化系统、活性氧代谢等部分生理特征的影响,以揭示高山离子芥在干旱胁迫下的生理响应特征,为进一步探讨其对干旱环境的适应机制奠定基础。结果显示:(1)随着干旱胁迫程度的增加以及在各时间胁迫处理下,抗氧化酶SOD活性及可溶性糖含量显著升高,POD活性、丙二醛含量、CAT活性和APX活性均经历了先升后降的过程。(2)超氧阴离子(O-·2)的产生速率和过氧化氢(H2O2)的含量均显著升高;高山离子芥试管苗叶片相对电导率呈现出升-降-升的变化趋势。(3)相关分析结果显示,MDA与相对电导率、可溶性糖、SOD、APX、O-·2及H2O2呈极显著正相关关系,可溶性糖与SOD、POD、O-·2及H2O2呈极显著正相关关系;相对电导率以及保护酶系均与O-·2、H2O2呈极显著正相关关系。研究表明,高山离子芥具有较强的耐旱性,高山离子芥试管苗在响应干旱胁迫过程中,抗氧化酶系、活性氧代谢、脂质过氧化及渗透调节物等共同参与了高山离子芥试管苗对干旱胁迫的综合抗逆性形成,从而积极启动应对外界干旱环境的耐旱响应机制。

H_2S对干旱胁迫下高山离子芥的作用研究

以高山冰缘植物高山离子芥(Chorispora bungeana)试管苗为实验材料,研究了0. 3 mol·L^(-1)甘露醇模拟干旱胁迫响应过程中硫化氢(H_2S)调节高山离子芥的膜系统损伤程度、渗透调节物质和抗氧化酶系的作用,以及磷脂酶D(PLD)、活性氧(ROS)与H_2S信号分子在高山离子芥中响应干旱胁迫中的作用和可能存在的信号关系。结果显示:干旱胁迫下,外施H_2S供体NaHS显著降低高山离子芥电解质渗漏率及MDA含量、抑制ROS产生,提高渗透调节物质和抗氧化水平,从而增强高山离子芥的抗旱能力;干旱可诱导PLD活性、H_2S含量、ROS发生显著变化;当分别外施PLD下游产物PA与ROS供体H_2O_2均可促进干旱胁迫下H_2S的释放,当同时外施PA和ROS抑制剂DPI时对干旱胁迫下H_2S含量没有显著影响,当同时外施PLD抑制剂正丁醇与ROS抑制剂DPI则显著抑制干旱胁迫下H_2S含量的产生,表明干旱胁迫下,高山离子芥中ROS位于PLD的下游、H_2S的上游发挥作用。

高山冰缘植物高山离子芥体外抗氧化活性研究

以高山冰缘十字花科植物高山离子芥(Chorispora bungeana)为研究对象,分析比较了其水提物和醇提物中总黄酮含量以及它们的抗氧化能力.结果表明:水提物和醇提物能够直接清除DPPH、超氧阴离子、羟自由基,抑制脂质过氧化.与水提物相比,醇提物总黄酮含量较高,抗氧化活性更强.高山离子芥水提物和醇提物在体外具有明显的抗氧化活性,而较高的总黄酮是其适应高山严酷环境的主要特性之一.研究结果对揭示极端环境下生长的植物抗性机理和资源的进一步开发利用提供了科学依据.

高山离子芥CBF/DREB1转录因子基因的分离与表达(英文)

以冷胁迫和脱水处理的高山离子芥幼叶为材料,采用RT-PCR技术获得1条新的C重复/脱水应答元件结合因子(CBF/DREB1)基因(CbCBF,登录号AY994127)。该基因含651 bp的开放阅读框(ORF),编码216个氨基酸的蛋白质,预测该蛋白具有一个AP2 DAN结合域,一个核定位信号和碳端酸性激活域。多序列比对结果表明,CbCBF蛋白与拟南芥及其他植物CBF具有较高的相似性。Northern杂交结果显示,CbCBF基因不能被冷处理诱导表达,但可被脱水和ABA处理快速诱导;同时发现CbCBF基因也能被紫外辐射和机械刺激诱导表达。表明高山离子芥CbCBF基因可能参与应答多种非生物胁迫过程。

高山离子芥水提物对四氯化碳诱导的急性肝损伤的影响

目的评价高山离子芥水提物在四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠急性肝损伤中的作用,并阐明其可能机制。方法高山离子芥水提物预处理7 d后,小鼠腹腔注射CCl4石蜡油溶液。测定肝脏指数,血清中天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平,肝组织中丙二醛(MDA)水平以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。结果高山离子芥水提物呈剂量依赖性地降低肝脏指数,AST、ALT、MDA水平,提高SOD和GSH-Px活性。结论高山离子芥水提物是有效的抗化学性肝损伤的护肝剂,可能与其抗氧化活性有关。

高山离子芥CbPLDβ基因对转基因烟草抗寒性的影响

为分析高山离子芥CbPLDβ基因的抗寒性价值,本实验构建了高山离子芥CbPLDβ的表达载体PBI121-CbPLDβ并转化烟草,经过筛选及PCR测序鉴定,获得转基因烟草植株.通过低温胁迫实验,分析了转基因烟草的抗寒性,结果表明:外源基因已经整合到烟草基因组中,在低温胁迫下转基因烟草植株的电解质渗透率普遍低于野生型烟草,而游离脯氨酸含量、可溶性糖和可溶性蛋白的含量均高于野生型烟草,说明CbPLDβ基因提高了烟草抵抗低温的能力.

低温条件下高山离子芥SA的产生及NO对SA质量分数的影响

研究了高山离子芥在低温条件下SA的产生及NO对SA质量分数的影响.结果表明:低温胁迫下,高山离子芥悬浮细胞内源SA质量分数逐渐增强,随着温度的降低,SA质量分数逐渐增强.在0℃处理下,8 h达到最高(2.14μg/g),4℃处理下,24 h达到最高(1.6027μg/g);随着温度的降低,高山离子芥悬浮细胞内NO质量分数明显增强.在NO促进剂SNP、NO合酶(NOS)抑制剂LNNA、NO专一性猝灭剂PTIO及硝酸还原酶(NR)抑制剂NaN_3处理下,研究高山离子芥NO及内源SA质量分数的变化.结果表明:SNP诱发了高山离子芥悬浮细胞内NO及SA的合成积累,LNNA,PTIO抑制了细胞中NO及SA的合成积累,NaN_3对SA影响效果不明显,对NO影响效果显著.每个处理下的高山离子芥在低温条件下的内源SA质量分数均高于常温(20℃)水平,且差异显著(P<0.05).SNP与LNNA,PTIO,NaN_3复合处理中,LNNA与PTIO对SA的抑制作用被消除.

高山离子芥愈伤组织总RNA的提取方法研究

为了探寻提取高山离子芥(Chorispora bungeana)总RNA的最佳方法和条件。本研究分别采用改良的Trizol法、柱式离心法和CTAB法提取高山离子芥RNA,比较其得率、纯度、完整性和反转录后的PCR扩增效果;并对RNA的保存以及去RNA酶的处理进行了优化。结果表明,改良的Trizol法提取的RNA纯度和得率高、完整性好,转录后的PCR扩增效果好;RNA提取后室温保存8h内降解较少,-80℃至少保存30d。枪头、离心管等去RNA酶处理不完全会导致大量RNA降解,电泳槽等工具及电泳液的RNA酶灭活不彻底会使RNA在电泳过程中降解。

高山离子芥耐冷基因的挖掘

冰缘植物高山离子芥具有极强的抗寒能力,具葶离子芥为其同属近缘种,但抗寒性远不及高山离子芥。本试验以高山离子芥和具葶离子芥植株为材料,对这2种离子芥进行低温处理,并采用c DNA扩增片段长度多态性(c DNA-AFLP)技术对其进行耐冷相关基因筛选,共获得与耐冷相关的28条差异表达片段,其中7条来自具葶离子芥,21条来自高山离子芥,并对这28条差异表达的片段进行生物信息学分析。选取高山离子芥特有的5条差异表达片段(TDFs),采用Realtime RT-PCR进行低温诱导表达验证,结果表明确实是低温诱导的特异表达片段。本试验结果为高山离子芥特有耐冷基因的功能研究及其应用提供了依据。

高山离子芥水提物对小鼠脑缺血再灌注后炎症反应的影响

目的观察高山离子芥水提物对脑缺血再灌注后脑组织炎症反应的影响。方法雄性ICR小鼠随机分为模型组、假手术组、高山离子芥低、中、高剂量组和依达拉奉组。建立小鼠大脑中动脉栓塞/再灌注模型。采用HE染色法观察组织病理学变化,免疫组化法测定细胞黏附分子-1表达,比色法测定髓过氧化物酶活性。结果脑缺血再灌注导致组织病理学损伤、细胞黏附分子-1表达及髓过氧化物酶活性增加。与模型组相比,高山离子芥组组织病理学变化减轻、细胞黏附分子-1表达及髓过氧化物酶活性明显降低。结论高山离子芥水提物可改善脑缺血再灌注所诱导的炎症损伤。

高山离子芥铁转运蛋白基因编码序列的克隆及其抗逆性表达的实时定量分析

铁转运蛋白(iron transport protein,IRT)是具有跨膜运输离子功能的特殊蛋白质,属于金属离子转运家族的成员.本研究运用RACE方法从高山离子芥(Chorispora bungeana)中克隆得到完整的铁转运蛋白cDNA,命名为CbIRT(基因登录号为EU330924).该基因全长1290 bp,包含1个1035 bp的开放阅读框(ORF),编码344个氨基酸的蛋白.系统进化树分析显示,该基因与拟南芥AtIRT1和遏蓝菜TcIRT-G的亲缘关系最近,同源性分别达到了87.4%和86.5%,而在氨基酸序列水平与拟南芥AtIRT1的同源性达到了89%,表明克隆得到的CbIRT属于金属离子转运体家族成员.实时荧光定量方法对高山离子芥CbIRT基因在不同温度和铁营养水平条件下的表达情况进行分析表明,CbIRT对零下低温和零上低温的表达水平呈截然不同的反应;正常铁营养状态下,CbIRT是微量表达的,而缺铁及低温处理都可以大幅度地促进该基因的表达,富铁可以抑制该基因的表达.显示了该蛋白在转运Fe离子方面的重要作用.

高山离子芥营养器官的结构与环境的关系研究

高山离子芥营养器官的解剖学研究表明：根次生结构具较厚的周皮，次生韧皮部中具发达的腔隙薄壁组织。茎的初生结构中，皮层和髓部具发达的腔隙薄壁组织；在次生结构中无周皮，表皮和皮层均存在。皮层中除具腔隙薄壁组织外，还分布有由异常形成层活动形成的壁非木质化加厚的厚壁组织，紧邻髓部的木质部中也有呈连续花环状分布的壁非木质化加厚的厚壁组织。叶片表皮细胞壁具非木质化加厚的特点，叶肉中具发达的通气组织，栅栏组织细胞３～４层，主脉维管束上下两侧均有壁非木质化加厚的厚壁组织，主脉维管束与上。

低温胁迫下油菜素内酯对高山离子芥悬浮细胞膜系统的影响

为研究低温胁迫下油菜素内酯(brassinosteroids,BRs)对植物细胞膜系统的影响,使用24-表油菜素内酯(24-epibrassinolide,EBR)在4℃处理高山离子芥(Chorispora bungeana)悬浮细胞.结果显示,低温胁迫下高山离子芥悬浮细胞的离子渗漏率和丙二醛(MDA)含量明显升高,而EBR处理显著降低了细胞的离子渗漏率和MDA含量.此外,低温胁迫下,EBR处理在一定程度上提高了膜脂脂肪酸不饱和程度并明显增强了细胞质膜H+-ATPase,K+-ATPase,Ca2+-ATPase以及Mg2+-ATPase的活性.另外,低温诱导CbCOR15基因大量表达.而在低温胁迫初期,EBR处理细胞的CbCOR15基因表达水平更高.以上实验结果表明,EBR在稳定低温胁迫下高山离子芥悬浮细胞膜系统的结构与功能方面发挥积极作用,从而保证细胞生理代谢的正常进行,以提高其抗寒能力.