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抗药性相关糜蛋白酶基因真核表达载体的构建和鉴定 被引量:1
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作者 杨明夏 胡莺 +4 位作者 沈波 马磊 李秀兰 秦黎 朱昌亮 《南京医科大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期95-97,共3页
目的:构建抗药性相关基因真核表达载体。方法:采用PCR方法,以淡色库蚊抗药性品系cDNA文库为模板,扩增出抗药性品系中高表达糜蛋白酶(chymotrypsin)基因,经T/A克隆测序鉴定后,扩增、纯化质粒,经双酶切后纯化目的片段,克隆到真核荧光表达... 目的:构建抗药性相关基因真核表达载体。方法:采用PCR方法,以淡色库蚊抗药性品系cDNA文库为模板,扩增出抗药性品系中高表达糜蛋白酶(chymotrypsin)基因,经T/A克隆测序鉴定后,扩增、纯化质粒,经双酶切后纯化目的片段,克隆到真核荧光表达载体pEGFP-C3中。结果:PCR和酶切鉴定表明,构建成功真核荧光表达载体pEGFP-C3/chymotrypsin。结论:PCR加双酶切鉴定的方法构建表达质粒,迅速省时,结果可靠。 展开更多
关键词 抗药性 糜蛋白酶 基因表达载体 CDNA文库
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蚊抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系的建立与表达鉴定 被引量:1
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作者 顾燕 公茂庆 +4 位作者 胡小邦 孙艳 马磊 李秀兰 朱昌亮 《中国寄生虫病防治杂志》 CSCD 2005年第2期81-84,共4页
目的建立抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系。方法采用PCR方法,以淡色库蚊抗药性品系cD NA文库为模板,扩增出抗药性品系高表达的糜蛋白酶基因编码区;经T/A克隆测序鉴定后,亚克隆到真核表达载体pIE13,构建重组昆虫细胞表达载体pIE13/... 目的建立抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系。方法采用PCR方法,以淡色库蚊抗药性品系cD NA文库为模板,扩增出抗药性品系高表达的糜蛋白酶基因编码区;经T/A克隆测序鉴定后,亚克隆到真核表达载体pIE13,构建重组昆虫细胞表达载体pIE13/chy,经酶切和PCR鉴定后,与带有筛选标记的pIE1neo质粒共转染蚊细胞C6/36,通过G418选择培养,建立转染细胞系;用RT PCR、Westernblotting鉴定糜蛋白酶基因的转录表达。结果成功构建了真核表达载体pIE13/chy,证明糜蛋白酶基因已转入C6/36细胞,建立了稳定转染细胞系,表达产物分子质量单位约30ku,与理论值相符。结论稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究糜蛋白酶基因与抗药性的关系奠定了基础。 展开更多
关键词 糜蛋白酶基因 昆虫细胞表达载体 抗药性 基因转染 C6/36细胞
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一个新的家蚕kunitz类型CI基因的克隆和序列分析
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作者 赵萍 李娟 +2 位作者 林英 夏庆友 向仲怀 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期195-200,共6页
家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymotrypsin inhibitor,CI)的多个编码基因位于多个染色体位点上,是家蚕CI具有丰富多态性的原因之一。根据Gene Bank中登录的家蚕CI基因Sci-sb的mRNA,设计引物克隆了一个家蚕kunitz类型的CI基因,命名为CI-fb。C... 家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymotrypsin inhibitor,CI)的多个编码基因位于多个染色体位点上,是家蚕CI具有丰富多态性的原因之一。根据Gene Bank中登录的家蚕CI基因Sci-sb的mRNA,设计引物克隆了一个家蚕kunitz类型的CI基因,命名为CI-fb。CI-fb基因有3个外显子,开放阅读框长度为255 bp,编码85个氨基酸残基,具有一个典型的kunitz结构域。CI-fb基因与其他已知的kunitz类型的CI基因相比,在基因序列和结构、蛋白序列和结构上高度相似,但在已知的CI基因家族中序列最短。RT-PCR分析表明,CI-fb基因在家蚕的脂肪体、精巢、卵巢、马氏管、气管和中肠6个组织中表达,而在丝腺、血细胞和体壁中没有表达,是一个组织特异性表达的基因。研究结果为进一步研究家蚕CI的多态性和功能提供了新的线索。 展开更多
关键词 家蚕 胰凝乳蛋白酶抑制剂 基因克隆 CI-fo基因 组织表达
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家蚕CIb1基因启动子活性分析
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作者 赵巧玲 唐顺明 +5 位作者 易咏竹 赵秀振 沈兴家 朱良均 张国政 郭锡杰 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期477-481,共5页
用PCR方法从家蚕基因组DNA扩增了家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂b1基因(CIb1)4个不同长度的启动子片段,构建由其驱动的萤火虫荧光素酶基因报告质粒,在脂质体介导下转染家蚕BmN细胞,体外分析了该基因启动子的活性。结果表明,家蚕CIb1基因启动子... 用PCR方法从家蚕基因组DNA扩增了家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂b1基因(CIb1)4个不同长度的启动子片段,构建由其驱动的萤火虫荧光素酶基因报告质粒,在脂质体介导下转染家蚕BmN细胞,体外分析了该基因启动子的活性。结果表明,家蚕CIb1基因启动子在BmN细胞中有微弱的转录活性;野生型BmNPV感染能增强启动子活性;hr3增强的不同长度CIb1基因启动子片段的活性有显著差异,提示转录起始位点上游-74~-1nt包含了启动子的基本元件,而在-687~-465nt、-465~-317nt和-317~-74nt存在着主要的顺式元件。试验结果有助于阐明CIb1的表达调控机理和对家蚕天然性免疫的理解。 展开更多
关键词 家蚕 胰凝乳蛋白酶抑制剂 CIb1基因启动子 家蚕核型多角体病毒 同源重复区3
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家蚕类胰凝乳蛋白酶基因的发掘与表达特征分析
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作者 龙菲菲 席建 +2 位作者 张进 司马杨虎 徐世清 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期424-433,共10页
类胰凝乳蛋白酶(CTLP)是鳞翅目昆虫幼虫中肠中的主要蛋白酶。基于构建的家蚕中肠等组织差异表达基因的SSH文库,发掘和克隆了一条新的家蚕类胰凝乳蛋白酶基因Ctlp(GenBank登录号:JQ081296)。该基因定位于18号染色体nscaf2901,靠近端粒,有... 类胰凝乳蛋白酶(CTLP)是鳞翅目昆虫幼虫中肠中的主要蛋白酶。基于构建的家蚕中肠等组织差异表达基因的SSH文库,发掘和克隆了一条新的家蚕类胰凝乳蛋白酶基因Ctlp(GenBank登录号:JQ081296)。该基因定位于18号染色体nscaf2901,靠近端粒,有5个外显子和4个内含子,全长cDNA序列976 bp,ORF为840 bp,编码279个氨基酸残基,信号肽序列1~18 aa(分值0.985),1~20 aa和50~100 aa区域为2个由内到外的跨膜螺旋,推测蛋白质相对分子质量为29 780.10,pI为8.75,蛋白质功能域(保守区)和分子进化分析显示其为丝氨酸蛋白酶家族的类胰凝乳蛋白酶。家蚕Ctlp基因具有在5龄幼虫中肠特异性高表达和伴随进食量增加而上调表达的特征,同时也具有性别差异性和熟蚕期特异性上调表达的现象,暗示CTLP可能具有促进消化以外的功能。构建pET32a-ctlp重组表达载体,SDS-PAGE分析和Western blot鉴定结果显示,重组蛋白在原核表达系统中的表达量较低。 展开更多
关键词 家蚕 类胰凝乳蛋白酶 基因克隆 表达谱 原核表达
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西南地区汉族人群慢性胰腺炎糜蛋白酶C基因突变分析
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作者 汪洋 严茂林 陈和平 《山东医药》 CAS 2018年第38期1-4,共4页
目的分析西南地区汉族人群慢性胰腺炎(CP)糜蛋白酶C(CTRC)基因突变情况,从基因层面探讨西南地区汉族人群CP发病的机制。方法收集108例西南地区汉族CP患者(CP组)和150例健康对照者(对照组)的外周血,提取白细胞核DNA进行CTRC基因全外显子... 目的分析西南地区汉族人群慢性胰腺炎(CP)糜蛋白酶C(CTRC)基因突变情况,从基因层面探讨西南地区汉族人群CP发病的机制。方法收集108例西南地区汉族CP患者(CP组)和150例健康对照者(对照组)的外周血,提取白细胞核DNA进行CTRC基因全外显子测序,在线分析比较测序结果,分析CTRC基因突变情况。建立显性遗传模型,根据临床资料分析遗传与吸烟、饮酒的相关性。结果 CP组CTRC基因外显子检出c. 611G> A、c. 703G> T、c. 736C> T杂合错义突变各1例,对照组外显子区域未检出CTRC基因突变。另外发现5个单核苷酸多态性(SNP)位点,均位于内含子区域,分别为c. 40+92T> A、c. 40+133G> A、c. 493+49G> C、c. 493+51C> A、c. 793-137A> G,其中CP组上述位点发生频率分别为0、12. 96%、19. 44%、7. 41%、16. 67%,对照组上述位点发生频率分别为2. 67%、5. 33%、7. 33%、6. 67%、16. 00%,CP组c. 40+133G> A、c. 493+49G> C位点发生频率高于对照组(P均<0. 05)。CP组SNP位点c. 40+133G> A、c. 493+49G> C基因型频率和等位基因频率均高于对照组(P <0. 05或<0. 01)。在显性模型下,CP组与对照组携带c. 40+133G> A位点或c. 493+49G> C位点改变的人群,CP患病风险均增加(P均<0. 05)。在吸烟因素存在的情况下,c. 493+49G> C位点改变的组间分布差异有统计学意义(OR=4. 667,95%CI为1. 341~16. 239,P <0. 05)。结论 c. 611G> A、c. 703G> T、c. 736C> T杂合错义突变可能与西南汉族人群CP发病有关,SNP位点c. 40+133G> A和c. 493+49G> C可能为西南地区汉族人群CP易感位点,有SNP位点c. 493+49G> C改变的吸烟者可能有CP发病倾向。 展开更多
关键词 慢性胰腺炎 糜蛋白酶C基因 单核苷酸多态性 基因变异 西南地区 汉族
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Chromosomal localization of silkworm (Bombyx mori) sericin gene 1 and chymotrypsin inhibitor 13 using fluorescence in situ hybridization 被引量:2
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作者 Yutaka BANNO Hiroshi FUJII 《Science China(Life Sciences)》 SCIE CAS 2008年第2期133-139,共7页
The chromosomal locations of two single-copy genes, Ser-1 and CI-13, in silkworm (Bombyx mori) were detected at the molecular cytogenetics level by fluorescence in situ hybridization in the study. The results showed t... The chromosomal locations of two single-copy genes, Ser-1 and CI-13, in silkworm (Bombyx mori) were detected at the molecular cytogenetics level by fluorescence in situ hybridization in the study. The results showed that Ser-1 is located near the distal end of the 11th linkage group, relatively at the 12.5±1.4 position in pachytene; and that CI-13 has been mapped near the distal end of the 2nd linkage group, relatively at the 8.2±1.2 position in pachytene. Furthermore, their location model map-FISH map on silkworm chromosome was drawn. The FISH technique and its application to silkworm are also discussed in this paper. 展开更多
关键词 Bombyx mori SERICIN gene 1(Ser-1) chymotrypsin inhibitor 13 gene (CI-13) fluorescence in SITU hybridization chromosome mapping
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Over-transcription of genes in a parathion-resistant strain of mosquito Culex pipiens quinquefasciatus 被引量:1
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作者 Wei Wang Si-Lu Liu +3 位作者 Yang-Yang Liu Chuan-Ling Qiao Shao-Liang Chen Feng Cui 《Insect Science》 SCIE CAS CSCD 2015年第1期150-156,共7页
Insecticide resistance is an evolutionary adaptation that develops quite quickly in mosquitoes because of the high selection pressure of chemical insecticides, rapid generation time and large population size. Identifi... Insecticide resistance is an evolutionary adaptation that develops quite quickly in mosquitoes because of the high selection pressure of chemical insecticides, rapid generation time and large population size. Identification of genes associated with insecticide resistance is fundamental to understand the complex processes responsible for resistance. We compared the gene transcriptional profiles of parathion-resistant and -susceptible Culex pipiens quinquefasciatus using a combination of suppression subtractive hybridization and complementary DNA (cDNA) microarray techniques. A total of 278 colonies were selected from the resistant-susceptible mosquito subtractive library, 38 of which showed more than two fold stronger immunoblotting signals in the resistant strain than in the susceptible strain using cDNA microarray selection. The sequencing results showed that the 38 colonies can be matched to 12 genes of C. p. quinquefasciatus. Eight genes were confirmed to be overexpressed by more than two fold in the resistant strain. These genes encode chymotrypsin-1, theta glutathione S-transferase, lipase 3, larval serum protein 1β chain, cytochrome b, mitochondrial ribosomal large subunit, 28S rRNA, and a protein with unknown function. This study serves as a preliminary attempt to identify new genes associated with organophosphate resistance in this mosquito species and provides insights into the complicated physiological phenomenon of insecticide resistance. 展开更多
关键词 cDNA microarray chymotrypsin gene up-regulation insecticide resistance suppression subtractive hybridization theta glutathione S-transferase
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Chymotrypsin B is not just a digest enzyme but widely expressed in rat tissues
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作者 Dongxu Cao, Taotao Wei, Fuyu Yang National Laboratory of Bio macromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, 15 Datun Road, Chaoyang District, Beijing, 100101, China 《生物物理学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第S1期192-192,共1页
The functions of lysosomal proteolytic enzymes were once believed to be limited to intracellular protein degradation occured within the lysosome. Recent findings suggest
关键词 LYSOSOME chymotrypsin B real time qPCR gene expression tissue distribution
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