CircCpsf6在N2a细胞中对细胞活力的抑制作用及其结合的蛋白功能富集分析

目的探讨CircCpsf6在N2a细胞中对细胞活力的影响,同时对CircCpsf6结合蛋白进行功能富集分析,预测CircCpsf6影响细胞活力的分子机制。方法在N2a细胞中转染CircCpsf6的siRNA或过表达质粒,对CircCpsf6进行敲减或过表达,用CCK-8法检测细胞活力。在CircCpsf6的接口处设计特异性探针,进行下拉实验,即CircCpsf6的反义纯化实验。经过磁珠吸附,蛋白的洗脱、纯化,蛋白的质谱检测,得到CircCpsf6可能结合的蛋白。利用在线网站STRING对这些蛋白之间可能存在的相互作用进行预测,同时利用在线网站DAVID进行蛋白功能富集分析。结果在N2a细胞中,CircCpsf6能够被有效的敲减或过表达(P<0.01),敲减CircCpsf6后,细胞活力上升(P<0.01);过表达CircCpsf6后,细胞活力下降(P<0.05)。经过CircCpsf6的反义纯化实验,发现CircCpsf6可能与385个蛋白结合。GO分析和KEGG富集分析提示CircCpsf6可能通过结合蛋白影响细胞的增殖或者凋亡,从而影响细胞活力。结论CircCpsf6能够抑制N2a细胞的细胞活力。CircCpsf6可能通过结合G6pdx、Pcx、Csl影响细胞增殖,通过结合2210010C04Rik、Try10、Gm2663影响细胞凋亡。

circRNA CPSF6核内转移促进同型半胱氨酸诱导的滋养细胞凋亡

目的探讨环状RNA剪切及多聚腺苷酸化特异因子6(circRNA CPSF6)在同型半胱氨酸(Hcy)致滋养细胞凋亡中的作用及机制。方法体外培养HTR-8/SVneo人绒毛膜滋养层细胞,分为对照组(0 mmol/L Hcy处理)与1 mmol/L Hcy处理组。采用免疫荧光细胞化学染色检测滋养细胞胱天蛋白酶3(caspase-3)的表达,Western blot法检测caspase-3蛋白水平;实时定量PCR检测circRNA CPSF6的mRNA表达水平;同时,运用小干涉RNA(siRNA)技术敲低滋养细胞circRNA CPSF6表达,Western blot法检测细胞caspase-3、caspase-9、B细胞淋巴瘤分子2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)表达;实时定量PCR检测circRNA CPSF6在Hcy处理前后滋养细胞胞质/胞核中的表达水平。结果与对照组相比,Hcy处理组caspase-3表达明显增加,circRNA CPSF6 mRNA表达上调;敲低circRNA CPSF6后,caspase-3表达降低,线粒体凋亡途径被抑制;正常培养的滋养细胞中circRNA CPSF6在胞质大量表达,而给予Hcy处理后,circRNA CPSF6主要在胞核表达。结论通过circRNA CPSF6核内转移激活线粒体凋亡途径促进Hcy诱导的滋养细胞凋亡。

CPSF6调控Notch信号通路促进破骨细胞分化及乳腺癌骨转移

目的:探讨剪切及多聚腺苷酸化特异因子6(cleavage and polyadenylation specificity factor,CPSF6)在乳腺癌骨转移中的作用及机制。方法:采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、免疫印迹法(Western blotting,WB)、免疫组织化学染色(immunohistochemical staining,IHC)分析12例乳腺癌骨转移患者转移灶及20例乳腺癌患者原发灶CPSF6表达情况。采用细胞实验和体内转移模型探索CPSF6对肿瘤细胞生长和转移能力的影响,及CPSF6敲低对乳腺癌细胞骨转移能力的影响。分析乳腺癌细胞通过CPSF6重塑细胞外微环境的能力,并检验CPSF6对下游靶基因的调控作用。结果:CPSF6在乳腺癌患者转移灶中表达水平显著增高。CPSF6与乳腺癌细胞的增殖和迁移能力正相关。在231-BM细胞中敲低CPSF6后,其分泌的细胞上清降低破骨细胞前体细胞向成熟细胞分化的能力。CPSF6敲低的细胞在小鼠体内形成溶骨性病灶的能力显著降低(P<0.01),而且转移灶外周的破骨细胞数量显著下降(P<0.01)。CPSF6缺失能下调肿瘤细胞内Notch通路配体JAG1的表达水平,导致微环境中破骨前体细胞Notch通路失活并抑制下游靶基因。结论:乳腺癌骨转移灶中存在CPSF6基因过度表达。CPSF6通过调控Notch信号通路,促进肿瘤组织周围破骨细胞的成熟和溶骨活性,从而导致乳腺癌的溶骨性骨转移。

CPSF6在晚期非小细胞肺癌中的表达及与预后的关系

目的探讨剪切及多聚腺苷酸化特异因子6(CPSF6)在晚期非小细胞肺癌中的表达情况及临床价值。方法利用TIMER2.0分析CPSF6在各肿瘤组织及癌旁组织中的表达差异,TCGA数据库的可视化平台GEPIA评估CPSF6在泛癌症背景下对总生存期的影响,使用GEPIA2工具比较肺癌不同病理分期(Ⅰ~Ⅳ期)中的CPSF6表达情况,在线检索TCGA数据库中肺腺癌和肺鳞癌的数据集,并进行生存和预后分析。收集2018年1月-2020年3月我院收治的74例晚期非小细胞肺癌患者肿瘤组织以及20例正常肺组织进行CPSF6免疫组化检测,Kaplan-Meier生存分析评估CPSF6表达与晚期非小细胞肺癌患者无进展生存期和总生存期的关系,单因素和多因素分析评估CPSF6对肺癌患者预后的意义。结果TIMER 2.0、TCGA数据库分析表明非小细胞肺癌患者肿瘤组织中CPSF6 mRNA水平高于癌旁组织(P<0.05),CPSF6与多种癌症(包括肺腺癌)患者的预后不良有关。CPSF6在晚期非小细胞肺癌组织表达高于正常肺组织,差异有统计学意义(P<0.05)。CPSF6表达增高与肿瘤大小、淋巴结转移情况及临床分期相关。Kaplan-Meier生存曲线显示,晚期非小细胞肺癌患者CPSF6表达增高,无进展生存期和总生存期降低。单因素及多因素分析显示,CPSF6的表达水平、淋巴结转移和临床分期均可作为晚期非小细胞肺癌患者的独立预后因子(P<0.05)。结论CPSF6在晚期非小细胞肺癌组织中表达增高,可能在其预后中发挥重要作用。

CPSF6在胶质母细胞瘤进展中的作用及相关调控机制研究

目的:研究mRNA前体切割和多聚腺苷酸化特异性因子6(polyadenylation specific factor 6,CPSF6)对人胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)细胞系U87和U251的增殖、迁移、侵袭以及ATP水平的影响,进一步探究其相关调控机制。方法:通过Western blot和免疫组化检测CPSF6在GBM组织中的表达水平,利用在线数据库分析CPSF6在GBM组织和配对的非肿瘤组织中的表达水平,同时分析CPSF6与GBM的组织学级别和患者预后的关系。构建敲低CPSF6的U87和U251稳定表达细胞株,并采用RT-qPCR和Western blot方法分别验证U87和U251细胞中CPSF6的敲低效率;利用CCK8和Transwell实验分别检测CPSF6敲降对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;ATP实验检测细胞内的ATP水平变化,确定CPSF6在GBM中的致癌作用。通过RNA-seq分析敲低CPSF6后GBM内mRNA 3′UTR变化情况,KEGG富集分析差异靶基因相关的信号通路。在富集出的信号通路指示下,利用透射电镜和Western blot实验进一步验证敲低CPSF6后GBM自噬的发生情况。结果:CPSF6在GBM组织中呈现出高表达,其表达水平随组织学级别的增加而升高,且与患者不良预后相关。在U87和U251中敲低CPSF6后,细胞的增殖、迁移及侵袭能力均明显降低,细胞内ATP水平下降。对RNA-seq结果分析表明,敲低CPSF6后发生3′UTR缩短事件的基因远多于3′UTR延长事件的基因;KEGG富集到自噬信号通路与肿瘤进展密切相关,透射电镜和Western blot实验验证敲低CPSF6可以促进自噬通路的激活。结论:CPSF6在GBM中高表达,且与GBM的组织学级别和患者不良预后呈正相关,CPSF6可能通过抑制自噬通路的激活来促进U87和U251细胞的增殖、迁移、侵袭以及ATP的生成,进而促进GBM发生、发展。