沙田柚花粉管特异蛋白的免疫细胞化学研究

从沙田柚自交花粉管中提取与自交不亲和相关蛋白,应用免疫胶体金标记抗体技术检测沙田柚Citrus grandis var. Shatinyu Hort.自花授粉后3 d 1/2花柱中花粉管特异蛋白的定位分布。结果表明,花粉管特异蛋白在花粉管中依次定位于内质网、细胞质和细胞纤维壁上。

沙田柚花粉蛋白质双向电泳分析

比较分析沙田柚花粉不同发育时期和自交、异交花粉蛋白质的双向凝胶电泳图谱 .随着花粉的发育 ,其蛋白质格局始终处于变化之中 ,单核期和双核期花粉中相对分子质量小的蛋白质明显增多 ,萌发的花粉中相对分子质量小的蛋白质亦较多 ,是与此时花粉生理活动旺盛有关 .自交、异交花粉蛋白质格局无明显差别 ,但是发现异交花粉管中一些蛋白质在自交花粉管中缺失或含量较低 ,说明自交条件下花粉管一些蛋白质表达可能受到了抑制 .该结果为“膜受体假说”提供了一个新的实验证据 .

沙田柚自交花柱中识别蛋白的免疫金定位

应用免疫金标记抗体技术检测了沙田柚自花授粉后 1～ 3d花柱 1/2处通道细胞中识别蛋白定位分布 ,表明金颗粒依次定位于内质网 ,高尔基体、纤维壁 ,证实沙田柚花柱1/2处通道细胞中金颗粒分布的变化与花粉管在花柱中生长受阻位点和时间一致。 1/2花柱通道细胞纤维壁上的糖蛋白是沙田柚不亲和反应的识别位点。

沙田柚自交和异交亲和性观察

用荧光显微镜和扫描电镜对沙田柚（Ｃｉｔｒｕｓｇｒａｎｄｉｓｖａｒ．ｓｈａｔｉｎｙｕＨｏｒｔ．）自交和异交亲和性进行了观察。沙田柚自、异交授粉后，花粉管通过柱头乳突细胞间隙进入柱头，先是在柱头区沿细胞间隙生长，长到花柱区后，一直沿花柱道内缘通道细胞长入子房。当花粉管伸长到花柱１／４～１／２时，自异交的花粉管生长速度和管壁胼胝质积累出现差异，自交花粉管在花柱１／２左右处停止生长，异交花粉管正常进入胚囊受精。花柱切面自交授粉管能萌发，但不能进入花柱道。花柱切面异交授粉和胎座授粉，花粉管均能进入胚囊，进行受精。柱头分泌液和柱头匀浆提取液进行花粉离体萌发，花粉能正常萌发和生长。实验结果表明，沙田柚自交不亲和识别和阻抑部位在花柱，属配子体不亲和型。

沙田柚自交不亲和花柱糖蛋白产生的时空关系

用辣根过氧化物酶标 Con A电镜细胞化学方法研究沙田柚不同发育时期的花柱通道细胞中糖蛋白的合成 ,分布和运输途径的动态变化。四分体期至开花期 ,在沙田柚花柱通道细胞中 ,内质网 (ER)合成糖蛋白呈颗粒状定位于核膜腔 ,内质网膜腔 ,质膜与细胞壁之间电子透明层中。授粉后 1～ 3d,内质网结构形态改变 ,由完整圆形变为开放 ,并囊泡化 ,大量线粒体集中于囊泡区 ,形成类似于哺乳动物腺外分泌细胞的高尔基区 ,内质网合成的糖蛋白在高尔基区膜囊中经糖基转移酶作用进一步浓缩凝结 ,形成与识别有关的糖蛋白 ,经高尔基小泡运送至通道细胞外壁。讨论了定位于通道细胞外壁的糖蛋白在沙田柚配子体型不亲和识别中的作用及与识别部位的关系。

沙田柚花柱蛋白对花粉管生长的影响

本文以沙田柚及其授粉树种酸柚为材料，对其花粉在不同培养介质中的萌发率进行测定，筛选了０２～０４ｍｏｌ／Ｌ聚乙二醇－４００（ＰＥＧ－４００）＋００１％硼酸作为花粉萌发介质。用授粉后３ｄ的花柱提取液进行沙田柚、酸柚花粉萌发抑制实验，花柱提取液对自交花粉萌发无抑制作用，明显地抑制花粉管的生长。其中以花柱提取液的３５％饱和度硫酸铵级分对花粉管伸长的抑制最明显。模拟了花粉在雌蕊中的生长方式，进行花粉萌发生长，能收集到较多的花粉管，为研究花粉管的Ｓ－糖蛋白提供了材料。

沙田柚自交花柱S_1-RNase的免疫胶体金定位

采用免疫胶体金标记抗体技术成功地检测了沙田柚自交花柱中存在的S1 RNase 结果表明 :沙田柚自花授粉后 1,2 ,3d 1/ 2处花柱段的S1 RNase分别定位于内质网、高尔基区、纤维内壁和纤维外壁 ;同时分析了自花授粉后 1～ 3d的S1 RNase的动态变化 ,及其参与沙田柚自交不亲和反应的可能机理 。

沙田柚S-RNase基因的克隆及序列分析

利用高通量测序技术对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序。通过差异分析得到沙田柚S-RNase基因序列。该基因全长为1 238bp(GenBank登录号为KP172529),开放阅读框(ORF)全长为834bp,共编码278个氨基酸,编码的蛋白质的相对分子质量为31.402kDa,理论等电点为5.30。S-RNase蛋白为亲水性蛋白,共有17个可能的磷酸化位点。氨基酸序列分析表明,其编码的氨基酸与柚Citrus maxima、沙糖桔Citrus reticulata和甜橙Citrus sinensis的同源性分别为99%、98%和96%。系统进化树显示沙田柚S-RNase基因与柚、沙糖桔和甜橙亲缘关系很近,属于同一进化分支。

沙田柚柱头表面结构及花粉管进入柱头细胞的研究

采用光学显微镜、扫描电镜及透射电镜技术对沙田柚柱头表面结构及其花粉萌发后花粉管进入柱头细胞途径的观察，结果如下：１）沙田柚的柱头乳突细胞为棒状，柱头表面正中有一大型开口的柱头沟结构，当柱头发育成熟后分泌出大量的粘液，故属湿型柱头．２）不论自交或异交，沙田柚的花粉落到花柱头上都能萌发，通过柱头乳突细胞间隙进入柱头，且沿着柱头区薄壁细胞间隙进入花柱，其自交不亲和性反应发生在花粉管通过花柱时，故沙田柚自交不亲和属配子体不亲和类型．３）无论是自交或异交，授粉后的柱头细胞经钌红染色显示．糖蛋白均明显地定位于乳突细胞的细胞壁表面上，在细胞壁外部形成一个糖蛋白层，有些呈颗粒状．４）在此试图讨论了配子体不亲和与孢子体不亲和花粉在柱头上的行为区别，以及沙田柚的柱头和花柱界面的分界．

沙田柚花粉管S1-RNase免疫胶体金定位研究

以10年生沙田柚结果树为材料,应用免疫胶体金标记抗体技术检测沙田柚(Citrus grandis var.Shatinyu Hort)自花授粉后3d、1/2花柱中花粉管S1-RNase免疫胶体金颗粒的定位分布。结果表明,在自交花粉管的内质网、细胞质和细胞纤维壁上有胶体金颗粒分布,而对照的内质网、细胞质和细胞纤维壁上均未发现有胶体金颗粒分布。因此,自交花粉管中S1-RNase分别定位于内质网、细胞质和细胞纤维壁上,该结果为沙田柚自交不亲和机理研究提供了参考依据。

沙田柚花柱蛋白提取液的生化特性研究

通过血凝活性和糖基抑制实验方法 ,对沙田柚不同发育时期 1 /2花柱蛋白提取液进行测定 实验结果揭示 ,花柱蛋白提取液中存在一种能与伴刀豆球形蛋白 (ConA)相结合的糖蛋白 ,具血凝活性 提取液中的糖蛋白的血凝活性能被甘露糖、N -乙酰葡萄糖、阿拉伯糖所抑制 ,说明糖蛋白中的单糖成分主要是甘露糖和乙酰葡萄糖类物质 随着花柱发育成熟 ,1 /2花柱提取液血凝活性反应强度有一明显变化梯度———单核期不明显 ,开花期次之 ,自交授粉后 2～ 3d最明显 。

沙田柚营养器官的初生结构及发育研究

通过对沙田柚根、茎、叶初生结构及其发育成次生结构过程作连续石蜡切片观察发现：沙田柚根的初生结构为１０原型．内皮层细胞卡氏带加厚不明显．根毛区近轴端稍后，维管形成层由初生木质部和初生韧皮部之间薄壁细胞转化形成，茎中维管束环形排列，在茎顶端第二节间，维管形成层环已开始活动形成了茎的次生结构．叶的栅栏组织由多层细胞组成，主脉维管束为周韧型，维管束外围绕一环石细胞．在叶的栅栏组织和表皮下有溶生分泌腔分布，但在根中未发现．

沙田柚种子化学成分的研究

从沙田柚种子中分离出一种柠檬苦素类似物，其结构经元素分析，ＭＳ，ＩＲ，￣１ＨＮＭＲ和￣（１３）ＣＮＭＲ确定为ｎｏｍｉｌｉｎ。

沙田柚各器官特异蛋白质的研究

利用SDS-PAGE对沙田柚 (Citrusgrandisvar.ShatinyuHort.)的茎、叶、花萼、花瓣、花药、花柱和子房的可溶性蛋白质进行比较分析 ,检测到茎中的分子质量 3 1 0ku,叶中的 56 0ku ,花药中的 59 0ku ,58 0ku,4 4 0ku ,3 7 2ku,3 6 0ku ,3 5 5ku,3 3 .0ku,2 1 .0ku,1 5.4ku,花柱中的 4 3 .0ku,3 8.5ku,子房中的 3 3 .5ku的蛋白质分别为各器官的特异蛋白质 对茎、叶、花药、花柱的全蛋白质进行IEF -SDS -PAGE双向电泳分析结果也确定了相应于各自SDS-PAGE上特异蛋白质带的特异斑点 ,而且 ,SDS-PAGE图谱上的一条蛋白质带在IEF -SDS-PAGE双向图谱上呈现等电点不同而分子质量相同的几个斑点 各器官的蛋白质含量以花药的最高 。

酶解压片分离沙田柚胚襄与胚胎发育研究

用２．５％纤维素酶与２．５％果胶酶混合液在３０℃下对已固定的沙田柚（Ｃｉｔｒｕｓｇｒａｎｄｉｓｖａｒ．ｓｈａｔｉｎｙｕＨｏｒｔ．）胚乳酶解６—１０小时，分离了开花前、授粉至受精间隔期、合子休眠期、胚和胚乳发育各期的胶囊．用Ｏｌｙｍｐａｓ相差显微装置进行观察与摄影，在胚囊中显示了沙田柚胚胎发育各主要阶段的结构特征。

沙田柚幼果挥发油成分的气相-质谱联用分析

目的:分析沙田柚幼果挥发油成分。方法:用水蒸气蒸馏法提取沙田柚幼果挥发油,用气相质谱联用(GC- MS)法对挥发油成分进行分析。结果:共分离出33个组分,经NIST谱库检索,鉴定了其中24 个化合物,并用峰面积归一化法确定了其相对含量。结论:沙田柚幼果挥发油主要成分有:香芹酚(29.79%)、D- 柠檬烯(29.02%)、β-石竹烯(19.27%)、α佛手柑烯(7.69%)、β-月桂烯(4.61%)、α- 石竹烯(2.31%)、奴卡酮(1.91%)等。

沙田柚自、异交授粉花柱中有机物的动态变化

对沙田柚的花柱结构，自、异交授粉后花柱中有机物的动态变化进行了组织化学测定和光镜观察，结果为：１）沙田柚花柱由表皮、皮层薄壁细胞、维管束和花柱道组成．花柱道由内表皮细胞即通道细胞和鞘细胞组成，花柱道的通道细胞为腺细胞，具传递细胞的结构特征．２）自、异交授粉后，花粉管从柱头进入花柱的生长过程中，花柱中的有机物依次出现了从皮层薄壁细胞→鞘细胞→通道细胞→花柱道的梯度变化。

沙田柚RING-H2 finger基因的生物信息学分析

为探讨沙田柚自交不亲和性的机理,利用高通量测序技术对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序,通过差异分析得到了沙田柚RING-H2 finger基因序列。采用生物信息学方法,对其编码的蛋白质从序列特征、理化性质、跨膜结构域、高级结构以及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明:该基因全长为845 bp,开放阅读框(ORF)全长为387 bp,编码128个氨基酸,编码蛋白质的分子量为13.61 KDa,理论等电点为4.26;该蛋白质含有一个植物RING-H2 finger蛋白家族的保守结构域,为疏水性不稳定蛋白。氨基酸序列分析表明,其编码的氨基酸与甜橙(Cs4g15340.1)RING-H2 finger蛋白的相似度为98%。这些分析结果可为今后深入研究该蛋白的结构特征和功能提供参考。

广西容县沙田柚与蜜柚营养成分的比较研究

[目的]对广西容县沙田与柚蜜柚两种柚子的蛋白质、总糖、维生素C、脂肪及灰分含量进行比较,为本地柚子资源的开发利用提供参考依据.[方法]分别用考马斯亮蓝法、蒽酮比色法、钼酸铵法及酸水解法测定蛋白质、总糖、维生素C及脂肪含量,高温灰化法测定灰分.[结果]实验表明沙田柚4种成分(蛋白质、总糖、维生素C、脂肪)含量均比蜜柚高,但蜜柚灰分含量较沙田柚高.[结论]总体上看沙田柚比蜜柚营养成分高.

沙田柚WRKY转录因子的克隆与序列分析

利用高通量测序技术对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序,差异分析得到沙田柚WRKY转录因子的序列。该基因的全长序列为1 178bp(GenBank accession No.KU173833),含有993bp的开放阅读框(ORF)可编码330个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量为37.00ku,理论等电点为5.79。与未授粉的花柱相比,沙田柚异花授粉1、2、3d花柱中WRKY转录因子基因的表达量(RPKM)分别为5.67、26.04、17.08;而自花授粉1、2、3d花柱中WRKY转录因子基因的表达量(RPKM)分别为15.67、14.96、3.89。氨基酸序列分析表明,该氨基酸序列与甜橙、金桔的同源性分别为98%、97%。系统进化分析发现沙田柚WRKY转录因子与甜橙、金桔的亲缘关系很近,属于一个分支。