TaqMan探针法实时荧光定量PCR检测西瓜潜隐病毒

【目的】西瓜潜隐病毒(Citrullus lanatus cryptic virus,CiLCV)是近年来新发生的一种重要种传病害,研究旨在建立基于TaqMan探针法的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR with TaqMan probes,TaqMan-qPCR)检测技术,为开展种子、种苗带毒鉴定和病害防控提供技术支撑。【方法】通过基于小RNA高通量测序技术在北京西瓜产地发现了CiLCV,并克隆CiLCV的dsRNA1和dsRNA2全长序列,设计特异性引物建立RT-PCR和TaqMan-qPCR检测方法。以黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottled mosaic virus)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus)、甜瓜内源病毒(Cucumis melo endornavirus)、瓜类褪绿病毒(cucurbit chlorotic yellows virus)、南瓜花叶病毒(squash mosaic virus)、番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus)、西瓜花叶病毒(watermelon mosaic virus)、小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus)8种常见病毒为对照进行检测方法特异性分析;利用建立的实时荧光定量标准曲线对方法灵敏度进行评价;进一步利用TaqMan-qPCR和RT-PCR技术监测我国葫芦科作物主产区的西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜(砧木)种苗带毒情况。【结果】通过分析获得的高质量小RNA数据,发现17条组装的contig与CiLCV基因组有较好同源性。进一步克隆获得CiLCV的dsRNA1和dsRNA2序列全长(分别为1603和1466 nt),发现其与河南省鉴定出的CiLCV同源性高达99.4%和99.8%(GenBank number KY081285、KY081284)。建立的RT-PCR检测技术对CiLCV有单一扩增条带;建立的TaqMan-qPCR检测技术具有较好特异性和灵敏度,且能够检测到最低拷贝数为2×10^(3)的病毒,灵敏度是RT-PCR的100倍。同时,发现有1份来自北京的西瓜种苗检出了CiLCV,而其余地区的西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜(砧木)种苗均未检出该病毒,表明我国葫芦科作物主产区种苗带毒情况总体不高。【结论】建立的TaqMan-qPCR检测CiLCV技术特异性强、灵敏度高,适用于口岸和实验室开展CiLCV快速检测和精准鉴定。鉴于CiLCV可以通过种子、种苗等传播方式快速扩散,我国应重视种子、种苗的带毒检测,防止带毒种子、种苗流入生产环节进而调运扩散至全国,给产业造成重大经济损失。

利用小RNA深度测序技术鉴定西瓜病毒病病原

西瓜是一种重要的园艺植物,近年来饱受病毒病危害。为明确西瓜病毒病害病原,对采自山西太谷区表现花叶、皱缩等症状的西瓜叶片进行小RNA深度测序,同时利用RT-PCR的方法并结合生物信息学的手段,综合分析造成西瓜花叶、皱缩症状的病毒病原。结果表明,表现皱缩、花叶症状的西瓜样品被瓜类蚜传黄化病毒(cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)、甜瓜潜隐病毒(cucumis melo cryptic virus,CmCV)、西瓜病毒A(watermelon virus A,WVA)、西瓜皱叶病毒2号(watermelon crinkle leaf-associated virus 2,WCLaV2)和黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)5种病毒复合侵染。利用RT-PCR的方法分别扩增获得5种病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列,进一步通过序列一致率分析和系统进化分析发现,本研究获得的西瓜CABYV分离物CABYV-SXJZ(GenBank登录号:OP957280)核苷酸序列与中国南瓜CABYV分离物Inner Mongolia(GenBank登录号:EU262627)的核苷酸序列一致率最高,达到100%;西瓜WVA分离物WVA-SXJZ(GenBank登录号:OP957281)核苷酸序列与同样来自中国瓠瓜WVA分离物WVA-Huizhou(Gen-Bank登录号:MK292710)和西瓜WVA分离物WVA-KF15(GenBank登录号:KY363796)核苷酸序列一致率最高,分别达到93.6%%和99.9%;WCLaV2分离物WCLaV2-SXJZ(GenBank登录号:OP957282)核苷酸序列与WCLaV2巴西西瓜分离物Ju-01(GenBank登录号:LC636075)核苷酸序列一致率最高,达到99.6%;本研究首次从西瓜上获得的CmCV分离物Cm-CV-SXJZ(GenBank登录号:OP957283)核苷酸序列与中国甜瓜分离物CmCV-HLJ(GenBank登录号:MH479773)的核苷酸一致率高达99.9%;本研究获得的CGMMV分离物CGMMV-SXJZ(GenBank登录号:OP957284)核苷酸序列与CGMMV分离物GDLZ(GenBank登录号:MK933286)、CG038(GenBank登录号:MH271443)、CGMMV-pXT1(GenBank登录号:KY753929)、eWT(GenBank登录号:KY753928)、C284R(GenBank登录号:KY753927)、CGMMV-XG(GenBank登录号:KP868654)、JD2(GenBank登录号:KM873785)和Anhui(GenBank登录号:KT236095)核苷酸序列一致率最高,均达到99.8%。