茶花CjAPL1基因干扰表达载体的构建与遗传转化

茶花CjAPL1基因是MADS-box基因家族的AP1同源基因,AP1基因对于植物花器官的发育具有重要调控功能。本实验选取CjAPL1基因中长度为292bp的基因干扰片段,采用双酶切方法构建了有反向重复序列的RNA干扰中间载体pUCC-CjAPL1。分别用Pst I单酶切pUCC-CjAPL1中间载体和pCAMBIA1300植物表达载体,将有反向重复序列的小片段与pCAMBIA1300大片段连接,得到最终植物干扰表达载体pCAMRNAi-CjAPL1。采用热激法转化农杆菌GV3101,花序浸染法转化野生型拟南芥植株。利用潮霉素筛选阳性植株,进一步进行PCR扩增验证和表型观察统计。结果表明,pCAMRNAi-CjAPL1表达载体构建完整,且干扰载体成功地导入拟南芥基因组中。转基因植株表现出雄蕊缺失1～2枚的花型变化,证明CjAPL1基因对于雄蕊等花器官的发育起到了调控作用。

重瓣山茶花器官发育相关基因CjAPL1的全长克隆与表达分析

为研究A功能基因在山茶花重瓣形成过程中所发挥的功能,利用同源克隆和RACE扩增方法,从重瓣山茶花品种‘金盘荔枝’发育早期的花芽中获得了山茶花AP基因全长cDNA,命名为CjAPL1,GenBank登录号JX657332。该基因全长1 149 bp,其中,开放阅读框(ORF)长度为741 bp,5’非编码区长度206 bp,3’非编码区长度202 bp。经氨基酸序列分析表明:CjAPL1基因编码一条含有246个氨基酸的蛋白质,与猕猴桃、八仙花等植物的Ap1蛋白同源性均在75%以上。Rea-time PCR结果显示,CjAPL1基因在‘金盘荔枝’不同发育时期花芽中的表达量为:花芽发育早III期>花芽发育早II期>花芽发育早I期>现蕾期,表达趋势表现为先逐渐升高而后急剧降低;花器官不同部位中的表达量为花柱最高,其次为子房和萼片,在雄蕊下部和外轮花上部中的表达量最低。这些差异表明,CjAPL1基因可能在‘金盘荔枝’重瓣花形成中发挥作用。

山茶花CjAPL1基因正义表达载体的构建及对拟南芥的转化分析

为研究山茶花CjAPL1基因对于重瓣花形成的作用,构建了pCAMBIA1300-CjAPL1正义植物表达载体,酶切结果显示,CjAPL1基因正向插入pCAMBIA1300的启动子和终止子之间,表明CjAPL1植物表达载体构建成功。将pCAMBIA1300-CjAPL1采用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,获得转基因阳性植株65株。随机挑选表型变异明显的3株进行PCR扩增都得到了目的条带,Southern杂交鉴定进一步确认为转基因阳性植株。同时荧光定量检测到在转基因植株中CjAPL1基因表现出较对照显著提高6~25倍的表达量。转基因阳性植株表型变异明显,花柱和雄蕊数相比野生型各增加1枚和1~4枚,萼片边缘发育成白色的瓣化状,表明在拟南芥中过量表达CjAPL1基因可以引起花器官形态的变异和数量的变化,因此该基因在花器官形成和重瓣花发育中具有显著的调控功能。