ClC-3氯通道蛋白磷酸化及其功能的研究进展

细胞容积调节广泛参与细胞的各种生理病理过程，如上皮细胞物质转运、物质代谢、细胞兴奋性、激素释放、细胞迁移、细胞增殖及细胞坏死凋亡等。

ClC-3氯通道蛋白调控细胞增殖机制的研究进展

Cl C-3是电压门控性氯离子通道家族的成员,主要作为容积激活性氯通道通过调节容积激活性氯电流[Cl,(vol)],调节细胞体积,细胞膜电位等影响细胞增殖。近年的研究发现Cl C-3也可通过调节有丝分裂前凝集(premitotic condensation,PMC)过程,或维持细胞囊泡酸化和细胞内氧压,或作为调控因子通过Akt-GSK-3β信号通路和Ca MKII调节的信号通路等途径参与细胞增殖的调控。

氯离子通道CLC-3在乳腺癌中的表达及临床意义

目的研究氯离子通道CLC-3在乳腺癌组织中的表达,探讨其在乳腺癌诊断方面的临床意义及为乳腺癌发生发展方面进一步研究提供基础。方法在27例行乳腺癌改良根治术的乳腺癌患者中,分别将乳腺癌癌灶和周围正常组织用抗CLC-3抗体进行免疫组织化学染色。结果CLC-3蛋白主要表达在瘤细胞的胞浆和/或胞膜上。由于没有组间差异,应用χ2检验进行组间比较,其中乳腺癌患者21例(77.77%)阳性,6例(22.33%)阴性;乳腺正常组织中3例(11.1%%)阳性,24例(88.9%)阴性。χ2为24.3,P小于0.05,说明良恶性之间有明显差异。结论氯离子通道CLC-3在乳腺癌组织中高表达,恶性之间有明显差异。提示氯离子通道在乳腺癌发生及发展过程中有着病理生理及病理方面的临床意义,为乳腺癌的诊断及进一步研究提供临床应用基础。

沉默ClC-3氯通道基因对HeLa细胞周期分布的影响

目的:探讨沉默HeLa细胞的ClC-3氯通道基因后细胞周期分布的变化及其作用机制。方法:依照siRNA设计原则构建沉默ClC-3基因的ClC-3 siRNA并转染HeLa细胞;实验分为空白对照组(control组)、转染试剂对照组(Lipo组)、阴性对照组(negative siRNA组)和ClC-3 siRNA组。采用real-time PCR检测ClC-3 siRNA的沉默效率;流式细胞术检测细胞周期分布情况;Western blot检测ClC-3蛋白及相关细胞周期蛋白(cyclin)D1、细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)4、CDK6、P21和P27等表达。结果:CIC-3 siRNA成功沉默HeLa细胞的ClC-3基因。和其它组相比,ClC-3 siRNA组的细胞周期被阻抑在G_0/G_1期。CIC-3 siRNA组的cyclin D1、CDK4和CDK6蛋白表达水平明显下降,P21和P27蛋白表达水平明显上升。结论:沉默HeLa细胞ClC-3氯通道基因可影响cyclin D1、CDK4、CDK6、P21和27蛋白的表达水平胆抑HeLa细胞周期停滞在G_0/G_1期。

ClC-3氯通道调节氧糖剥夺所诱导的小胶质细胞的表型转化

目的 :研究ClC-3氯通道在氧糖剥夺所致小胶质细胞表型转化中的作用。方法:应用小胶质细胞株(BV-2)制备氧糖剥夺模型,分别给予氯通道阻断剂DIDS和NPPB预处理BV-2细胞。通过MTT活性测定确定BV-2细胞损伤及药物的有效浓度;通过实时荧光定量PCR法测定细胞表型相关分子,如M1型相关分子[肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、CD86]和M2型相关分子[转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)、CD206]m RNA水平的表达;通过RNA干扰的方法下调ClC-3的表达,再给予氯通道阻断剂DIDS和NPPB干预,进一步检测细胞的MTT活性,观察药物作用效果。结果:预先给予DIDS(1和10μmol/L)和NPPB(1μmol/L)能够改善氧糖剥夺所诱导的BV-2细胞MTT活性下降,抑制M1型相关分子如TNF-α、IL-1β和CD86的表达并促进M2型相关分子(TGF-β和CD206)的表达;通过RNA干扰下调ClC-3的表达,能够消除DIDS和NPPB的作用。结论:ClC-3氯通道参与调控氧糖剥夺所致小胶质细胞的表型转化,阻断ClC-3氯通道抑制氧糖剥夺诱导小胶质细胞向M1型转化。

ClC-3氯通道对Thapsigargin触发的Ca2＋运动的影响

目的探讨ClC-3氯通道与Thapsigargin(TG)触发的Ca2+运动的关系。方法在PC12细胞中转染全长ClC-3cDNA,利用生物荧光影像分析系统测定胞质Ca2+技术探讨ClC-3氯通道对TG触发的Ca2+运动的影响。结果与对照组相比,ClC-3蛋白过表达对TG触发的PC12细胞静息[Ca2+]i的Ratio值和Ca2+释放的Ratio值无影响(P>0.05)。但使Ca2+内流量明显降低(P<0.05)。SK&F96365可以浓度依赖的抑制TG触发的Ca2+内流,但与对照细胞及空载体转染细胞相比,SK&F96365对ClC-3蛋白过表达细胞Ca2+内流的抑制作用明显减弱(P<0.05)。结论ClC-3蛋白参与TG触发的经Ca2+池操纵的Ca2+内流(store-operated Ca2+entry,SOCE)调节。

ClC-3氯通道研究进展

容积敏感性氯通道普遍存在于哺乳动物细胞 ,对维持细胞容积平衡、调节细胞电活动等多种生理功能发挥重要作用。ClC 3作为可能编码ICl.swell的基因 ,受到广泛关注。本文就近年来对ClC 3氯通道在通道特点。

氯通道蛋白-3在透明晶状体和老年性白内障患者晶状体上皮细胞中的表达

目的研究透明晶状体和老年性白内障患者晶状体上皮细胞氯通道蛋白-3(chloride channel protein 3,CLC-3)的表达。方法随机收集40例老年性白内障手术患者和5例透明晶状体(来自晶状体脱位患者)的晶状体前囊膜,采用免疫组织化学染色和免疫荧光技术检测晶状体上皮细胞CLC-3的表达。结果CLC-3阳性表达于晶状体上皮细胞的细胞膜。老年白内障组40张切片中,CLC-3表达均为阳性。而透明晶状体组5张切片中,4张阴性,1张可疑阳性。计算机图像分析结果,透明晶状体组平均吸光度(A)值明显低于老年白内障组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论老年性白内障患者晶状体上皮细胞CLC-3表达阳性,CLC-3可能参与老年性白内障的形成。

Ca^(2+)运动对α_1-肾上腺素受体引起内源性ClC-3氯通道表达的作用

目的 研究Ca2 +运动对α1 肾上腺素受体引起ClC 3氯通道表达的作用。方法 在A10细胞上 ,用RT PCR和Westernblot检测ClC 3mRNA和蛋白质表达情况。结果 苯肾上腺素 ( 10 μmol·L-1)和thapsigargin( 0 1μmol·L-1)可促进ClC 3mRNA和蛋白质的表达 ;SK&F963 65 ( 10 μmol·L-1)和genistein( 10 μmol·L-1)可抑制苯肾上腺素引起的ClC 3的表达 ,nifedipine( 10 μmol·L-1)无此作用。结论 在A10细胞上 ,通过钙池操纵性Ca2 +通道 (SOCC)的Ca2 +内流参与了α1 肾上腺素受体引起的内源性ClC 3氯通道的表达 ,而通过电压依赖性Ca2 +通道 (VDCC)的Ca2 +内流可能与此无关。蛋白酪氨酸激酶参与了ClC

冠心康对大鼠缺血再灌注损伤心肌氯通道ClC-2、ClC-3、CFTR表达的影响

目的观察中药复方冠心康对大鼠缺血再灌注损伤(MIRI)心肌细胞氯通道ClC-2、ClC-3、CFTR表达的影响。方法 40只SD雄性大鼠随机分为4组:假手术组、MIRI模型组、冠心康组、盐酸地尔硫卓组。冠心康按生药13g/(kg·d)灌胃给药,盐酸地尔硫卓按30mg/(kg·d)灌胃给药,假手术组和MIRI模型组分别于相同时间给予等容积的生理盐水灌胃,术前灌胃7d,每日1次。采用结扎大鼠心脏左冠状动脉前降支30min,再灌注2h复制大鼠MIRI模型,造模成功后,在MIRI结扎线以下区域至心尖取材,运用RT-PCR法检测ClC-2、ClC-3、CFTR mRNA表达水平和蛋白质印迹法检测ClC-2、ClC-3、CFTR蛋白的表达。结果氯通道相关基因ClC-2、ClC-3、CFTR mRNA相对表达量在MIRI模型组明显升高,冠心康组和盐酸地尔硫卓治疗组mRNA相对表达量则明显下降,差异均有统计学意义(P<0.01);氯通道相关基因ClC-2、ClC-3和CFTR蛋白相对表达量在MIRI模型组明显升高,冠心康组和盐酸地尔硫卓治疗组蛋白表达量则明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论冠心康对大鼠MIRI心肌组织具有明显的保护作用,其作用机制可能与调控心肌细胞氯通道相关蛋白的表达有关。

氯离子通道蛋白-3对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响

目的:观察氯离子通道蛋白-3(ClC-3)对胶质瘤BT-235细胞增殖和侵袭的影响的子机制。方法:采用siRNA技术构建ClC-3表达沉默的人胶质瘤BT-235细胞株,设为siClC-3组,并设置空白对照组和空载体组;采用Western bolting检测3组细胞中ClC-3的表达,CCK8法检测细胞增值活性,ranswell实验用于测定细胞侵袭能力,通过测量细胞容积检测细胞调控性容积下降率,流式细胞术用于测定细胞周期;采用Western bolting检测cyclin D1、MMP-2和MMP-9的表达。结果:相对于空白对照组,siClC-3组ClC-3表达明显降低(P<0.01),细胞增殖活性明显降低(P<0.01),细胞迁移率明显降低(P<0.01);空白对照组细胞调控性容积下降率为(79.35±2.31)%,而siClC组仅为(19.46±1.76)%,差异有统计学意义(P<0.01);培养48 h的空白对照组BT-235细胞G0/G1期占比率为(57.2±3.1)%,而siClC-3组G0/G1期占比率提升至(71.3±4.0)%,产生明显的G0/G1期阻滞,差异有统计学意义(P<0.01);相对于空白对照组,siClC-3组G1期调控蛋白cyclin D1、侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9表达水平明显降低(P<0.01)。结论:ClC-3能明显增强胶质瘤BT-235细胞增殖和侵袭能力,其作用机制与增加细胞调控性容积下降率,诱导cyclin D1、MMP-2和MMP-9表达有关。

SWE检查联合氯离子通道蛋白-3在诊断宫颈癌中的应用

本文探究实时剪切波弹性成像(SWE)联合氯离子通道蛋白-3(ClC-3)诊断宫颈癌的价值。选取疑似宫颈病变的105例患者作为研究对象,包括50例良性病变患者(良性病变组)和55例宫颈癌患者(宫颈癌组),选取同期50例体检健康者作为对照组。通过SWE检查所有受试者的弹性模量最大值、弹性模量平均值。采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法测定血清ClC-3 mRNA水平。以临床病理诊断为金标准,通过ROC曲线评价弹性模量最大值、弹性模量平均值、血清ClC-3 mRNA诊断宫颈癌的价值。与对照组和良性病变组相比,宫颈癌组患者弹性模量最大值、弹性模量平均值、血清ClC-3 mRNA水平升高(P<0.05)。弹性模量最大值和弹性模量平均值均与ClC-3 mRNA显著正相关(r=0.447,P<0.001),与单一检查相比,弹性模量最大值、弹性模量平均值、ClC-3 mRNA联合诊断宫颈癌的AUC和敏感度升高(P<0.05)。SWE成像参数与血清ClC-3 mRNA变化与宫颈癌发生具有一定相关性,SWE联合血清ClC-3 mRNA检查具有较高的宫颈癌诊断价值。

氯通道蛋白-3和水通道蛋白-1在大鼠半乳糖性白内障晶状体中表达水平的变化

目的研究大鼠半乳糖性白内障晶状体中氯离子通道蛋白-3(CLC-3)和水通道蛋白-1(AQP-1)表达水平的变化,探讨CLC-3和AQP-1与白内障发病的关系。方法健康清洁级Wistar大鼠88只随机分为空白对照组(8只)、生理盐水组(40只)和半乳糖性白内障模型组(Gal组)(40只)。生理盐水组和Gal组根据处理时间不同各亚分为5个亚组,每个亚组8只大鼠。Gal组单侧眼球后注射D-半乳糖生理盐水注射液,生理盐水组同期单侧眼球后注射等体积无菌生理盐水,每日裂隙灯下观察大鼠晶状体混浊的动态变化,并参照Kador等的分级标准分期记录。分别于第1次给药后第3、7、14、21、30天在全身麻醉下处死各组实验大鼠,摘出晶状体,应用实时荧光定量PCR法检测各组晶状体中CLC-3mRNA和AQP-1mRNA含量的变化。结果透明晶状体和半乳糖性白内障晶状体中均有CLC-3mRNA和AQP-1mRNA的表达;生理盐水组各时间点CLC-3mRNA和AQP-1mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05);Gal组于3、7、14d时CLC-3mRNA表达逐渐增高,均高于同期生理盐水组,到14d时约达正常水平的7倍,21d、30d时又有所下降,均低于同期生理盐水组(P<0.01);各时间点晶状体CLC-3mRNA含量两两比较,差异均有统计学意义(P<0.01);模型组于3d时AQP-1mRNA表达已下降,与同期生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.05),且随着白内障的进一步发展,AQP-1mRNA含量逐渐降低,均低于同期生理盐水组(P<0.01);各时间点晶状体AQP-1mRNA含量两两比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论晶状体中CLC-3和AQP-1表达的变化可能与白内障的发生发展有着密切的联系。

氯通道ClC-3反义寡核苷酸对过氧化氢诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的研究ClC3反义寡核苷酸对H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响。方法蛋白免疫印迹法检测ClC3蛋白表达;形态学方法、DNA琼脂糖电泳、MTT法和流式细胞仪观察和分析H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞形态学改变、DNA断裂、细胞存活率和凋亡率及ClC3反义寡核苷酸转染对其影响。结果ClC3反义寡核苷酸转染抑制内源性ClC3蛋白表达后,可加重H2O2诱导大鼠主动脉平滑肌细胞形态学改变及DNA断裂,细胞凋亡率由52.8%±13.6%增至75.7%±5.8%(n=6,P<0.01),而细胞存活率由48.9%±4.3%进一步降低为31.3%±4.3%(n=6,P<0.01)。结论ClC3反义寡核苷酸转染促进H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡。

氯离子通道ClC-3研究进展

ClC 3氯离子通道广泛分布于组织器官和各种细胞 ,ClC 3氯离子电流呈外向整合电流 ,在正性电位通道灭活 ,0mV左右出现反转电位 ,通道的离子渗透选择性是I->Cl-,能被氯通道阻断剂DIDS、tamoxifen和细胞外ATP抑制 ,被PKC磷酸化调节 。

ClC-3基因敲除不影响心肌细胞肿胀激活性氯通道的PKC敏感性

目的 :探讨小鼠心室肌细胞肿胀激活性氯 (VSORCl-)通道的蛋白激酶C (PKC)敏感性是否受ClC 3的影响 .方法 :采用基因打靶、RT PCR、膜片钳全细胞记录技术分别获得ClC 3基因敲除小鼠 (Clcn3-/ -)、验证心肌ClC 3mRNA表达、及记录VSORCl-电流 .结果 :①低渗条件下 1 μmol/L佛波酯 (PMA)明显增大VSORCl-电流 ;②等渗条件下PMA 预处理不影响基础电流 ,随后低渗刺激性VSORCl-电流激活时程明显缩短 ;③PMA对VSORCl-电流的增强作用在野生型和Clcn3-/ -小鼠无明显区别 ;④ 1 0 μmol/L白屈菜红硷 (CHE) 预处理明显抑制低渗激活性VSORCl-电流 ,并消除PMA 后处理对VSORCl-通道的上调作用 .结论 :小鼠心室肌细胞VSORCl-通道激活主要依赖于内源性PKC活性 ,VSORCl-通道的PKC依赖性不受ClC

ClC-3氯离子通道对高分化鼻咽癌细胞突起形成的影响

目的:探讨ClC-3氯离子通道在高分化鼻咽癌CNE-1细胞突起形成中的作用。方法:采用免疫荧光技术(Alexa Fluor 488标记抗体)检测CNE-1细胞中ClC-3蛋白的分布;MQAE荧光探针检测细胞内氯离子浓度;吸附式单通道膜片钳技术记录氯离子单通道活动;采用FAM标记的siRNA转染细胞,实验分为对照组、阴性对照(NC) siRNA组和ClC-3 siRNA组;激光共聚焦显微镜观察转染后绿色荧光情况,流式细胞术检测转染效率,Western blot法测ClC-3蛋白的表达,倒置显微镜下观察CNE-1细胞突起形成情况。结果:ClC-3蛋白主要分布于细胞膜和细胞质,且在细胞膜突起形成部位明显聚集;细胞突起处MQAE荧光弱,氯离子浓度较高,而突起根部荧光强,氯离子浓度较低;突起根部记录到翻转电位为4.06 mV的单通道电流,在-120 mV钳制电压下,该通道电导约为78.4pS;siRNA转染细胞48 h后,ClC-3 siRNA组细胞ClC-3蛋白表达量显著降低(P<0.01),且ClC-3 siRNA组细胞无片状伪足伸出,而对照组和NC siRNA组细胞伸出明显的片状伪足;此外,3组细胞均有数量不等的丝状伪足形成。结论:ClC-3影响CNE-1细胞贴壁生长时胞膜伸出突起、形成片状伪足的过程。

氯通道ClC-2融合蛋白的原核表达及体外磷酸化

目的检测ClC-2是否能被促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化,为进一步研究其在细胞增殖、分化过程中的调控机制提供基础。方法从含有家兔ClC-2cDNA的质粒pSPORT1中PCR扩增ClC-2胞浆内的羧基端DNA编码序列,构建重组载体pGEX-4T-1/ClC-2CT;重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21菌株;经异丙基β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导后,通过GluthathionSepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白;并行融合蛋白的体外磷酸化实验。结果酶切、测序鉴定重组载体pGEX-4T-1/ClC-2CT构建正确,并纯化得到GST/ClC-2CT融合蛋白。而且该融合蛋白能被MAPK磷酸化,而GST不能被MAPK磷酸化。结论氯通道ClC-2能被MAPK磷酸化。

小麦TaCLC-e-3AL基因功能分析及互作蛋白鉴定

【目的】分析小麦氯离子通道TaCLC-e-3AL基因功能并鉴定其互作蛋白,以解析TaCLC-e-3AL参与小麦响应低氮胁迫的作用机制。【方法】以拟南芥AtCLC-e氨基酸序列为参考序列,通过BlastP对小麦基因组数据库进行比对,获得TaCLC-e-3AL(TraesCS3A02G253600)、TaCLC-e-3B(TraesCS3B02G285500)和TaCLC-e-3DL(TraesCS3D02G254500)3个基因,分析其基因结构和系统进化关系。将TaCLC-e-3AL-p1300-GFP融合蛋白表达载体转化至小麦原生质体中,分析TaCLC-e-3AL的亚细胞定位特征;采用转基因拟南芥进行异源功能验证,利用酵母双杂交筛选与TaCLC-e-3AL相互作用的蛋白。【结果】生物信息学分析表明,TaCLC-e-3AL编码的蛋白含有11个跨膜结构域,与乌拉尔图小麦TuCLC-e同源性最高。组织表达量预测分析表明,TaCLC-e-3AL基因在小麦的叶片和茎部表达量较高。顺式作用元件分析表明,其可能响应光、激素以及逆境胁迫等信号。亚细胞定位显示,TaCLC-e-3AL蛋白经内质网分选后定位于叶绿体内。过表达TaCLC-e-3AL转基因拟南芥植株在低氮胁迫条件下可以储存更多的NO_(3)^(-),并能够维持植株体内NO_(3)^(-)/Cl^(-)的稳态,不引起植株根长和鲜重的显著变化。酵母双杂交文库筛选显示TaCLC-e-3AL与水通道、叶绿体a/b结合蛋白和电压依赖性阴离子通道3个蛋白互作,表明TaCLC-e-3AL可能与它们协同参与干旱胁迫响应、光合作用、信号传导等生物过程。【结论】小麦氯离子通道蛋白TaCLC-e-3AL位于叶绿体内。TaCLC-e-3AL基因转化至拟南芥中过表达,在低氮胁迫条件下较野生型可以在植株体内储存更多的NO_(3)^(-),并维持NO_(3)^(-)/Cl^(-)的值,表明TaCLC-e-3AL可能调控Cl^(-)和NO_(3)^(-)的协同运输。TaCLC-e-3AL通过与水通道蛋白、叶绿体a/b结合蛋白、电压依赖性阴离子通道蛋白互作,参与小麦的干旱胁迫、光合作用和离子胁迫应答。

力学刺激对成骨细胞ClC-3氯通道影响的实验研究

目的:观察不同时长的持续静压力刺激对成骨细胞形态和ClC-3氯通道的影响。方法:取小鼠成骨样细胞系MC3T3-E1随机分为两组,实验组在1atm持续性静压力下培养;对照组常规培养。培养8、24 h取各组细胞在倒置显微镜下观察细胞形态;q-RT PCR检测细胞Clcn3 mRNA表达水平。结果:持续静压力刺激后8 h,细胞形态与对照组相比无明显改变,但24 h后,细胞更细长,细胞间隙变大。q-RT PCR检测显示,压力刺激后各时间点成骨细胞Clcn3 mRNA表达水平均明显高于对照组(P<0.05),并且随压力刺激延长,Clcn3 mRNA表达水平也随之升高(P<0.05)。结论:一定时间和大小的力学刺激能引起成骨细胞形态及ClC-3氯通道的变化。