ClC-3氯离子通道对高分化鼻咽癌细胞突起形成的影响

目的:探讨ClC-3氯离子通道在高分化鼻咽癌CNE-1细胞突起形成中的作用。方法:采用免疫荧光技术(Alexa Fluor 488标记抗体)检测CNE-1细胞中ClC-3蛋白的分布;MQAE荧光探针检测细胞内氯离子浓度;吸附式单通道膜片钳技术记录氯离子单通道活动;采用FAM标记的siRNA转染细胞,实验分为对照组、阴性对照(NC) siRNA组和ClC-3 siRNA组;激光共聚焦显微镜观察转染后绿色荧光情况,流式细胞术检测转染效率,Western blot法测ClC-3蛋白的表达,倒置显微镜下观察CNE-1细胞突起形成情况。结果:ClC-3蛋白主要分布于细胞膜和细胞质,且在细胞膜突起形成部位明显聚集;细胞突起处MQAE荧光弱,氯离子浓度较高,而突起根部荧光强,氯离子浓度较低;突起根部记录到翻转电位为4.06 mV的单通道电流,在-120 mV钳制电压下,该通道电导约为78.4pS;siRNA转染细胞48 h后,ClC-3 siRNA组细胞ClC-3蛋白表达量显著降低(P<0.01),且ClC-3 siRNA组细胞无片状伪足伸出,而对照组和NC siRNA组细胞伸出明显的片状伪足;此外,3组细胞均有数量不等的丝状伪足形成。结论:ClC-3影响CNE-1细胞贴壁生长时胞膜伸出突起、形成片状伪足的过程。

氯离子通道CLC-3在乳腺癌中的表达及临床意义

目的研究氯离子通道CLC-3在乳腺癌组织中的表达,探讨其在乳腺癌诊断方面的临床意义及为乳腺癌发生发展方面进一步研究提供基础。方法在27例行乳腺癌改良根治术的乳腺癌患者中,分别将乳腺癌癌灶和周围正常组织用抗CLC-3抗体进行免疫组织化学染色。结果CLC-3蛋白主要表达在瘤细胞的胞浆和/或胞膜上。由于没有组间差异,应用χ2检验进行组间比较,其中乳腺癌患者21例(77.77%)阳性,6例(22.33%)阴性;乳腺正常组织中3例(11.1%%)阳性,24例(88.9%)阴性。χ2为24.3,P小于0.05,说明良恶性之间有明显差异。结论氯离子通道CLC-3在乳腺癌组织中高表达,恶性之间有明显差异。提示氯离子通道在乳腺癌发生及发展过程中有着病理生理及病理方面的临床意义,为乳腺癌的诊断及进一步研究提供临床应用基础。

ClC-3与BK离子通道在胶质瘤细胞侵袭性生长中的作用研究

目的观察3型氯离子通道(Cl C-3通道)与大电导钙激活K+通道(BK通道)在胶质瘤细胞中的表达;研究Cl C-3离子通道与BK离子通道在胶质瘤细胞侵袭性生长中的作用。方法 Western blot实验检测Cl C-3与BK通道分别在C6及U251胶质瘤细胞中的蛋白表达,免疫荧光技术检测两种通道蛋白在胶质瘤细胞中的形态学分布情况;采用Transwell侵袭实验检测应用Cl C-3通道特异性阻滞剂氯代毒素(Cl TX)以及BK通道特异性阻滞剂伊比蝎毒素(IBTX)后胶质瘤细胞侵袭能力的变化情况。结果 U251及C6胶质瘤细胞系均高度表达Cl C-3离子通道,而BK离子通道在两种胶质瘤系中的表达相对较低;应用Cl TX后U251细胞的侵袭性显著降低(P<0.05),且呈剂量依赖关系;应用IBTX后U251细胞的侵袭性无明显变化。结论 Cl C-3离子通道在胶质瘤侵袭性生长发挥重要作用,可作为未来治疗胶质瘤的新靶标。

ClC-3氯离子通道与肿瘤

ClC-3氯离子通道的功能主要是调节细胞容积和保持胞内囊泡腔电中性,是正常细胞生长和增殖必不可少的元件。近年研究发现ClC-3也与肿瘤的发生和发展密切相关,其在肿瘤组织中呈高表达,在肿瘤细胞周期和凋亡的调控以及细胞迁移等过程中扮演了重要的角色,有望成为抗肿瘤新靶点。

血管紧张素-(1-7)通过调控ClC-3氯离子通道及Nec对抗高糖诱导的内皮细胞损伤

目的:探讨ClC-3氯离子通道及RIP3在高糖(HG)损伤血管内皮细胞中的作用及血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]能否通过调控ClC-3氯离子通道及RIP3抑制HG引起的心肌细胞损伤。方法:应用western blot法检测ClC-3、RIP3(receptor-interacting protein kinase 3)蛋白的表达;细胞计数盒(CCK-8)测定细胞存活率;DCFH-DA染色荧光显微镜着测定细胞内ROS水平;罗丹明123(Rh123)染色荧光显微镜照相测定线粒体膜电位(MMP);SOD试剂盒检测SOD水平。结果:应用2μmol·L-1 Ang-(1-7)、20μmol·L-15-nitro-2-(3-phenylpropyl-amino)benzoic acid(NPPB)或10μmol·L-1 Nec-1(necrostatin 1)共处理HUVECs 24 h能显著地抑制HG对ClC-3、RIP3表达的上调作用;40 mmol·L-1葡萄糖(HG)处理心肌细胞24 h引起明显的损伤作用,是细胞存活率、SOD和MMP降低,细胞内ROS增多;Ang-(1-7)、NPPB及Nec-1或1μmol·L-1 Ang-(1-7)共处理HUVECs明显地抑制上述HG引起的损伤作用。结论:Ang-(1-7)通过抑制ClC-3氯离子通道及Nec(Necroptosis)保护血管内皮细胞对抗HG引起的损伤。

三苯氧胺(TAM)及靶向CLC-3反义核苷酸对MCF-7(ER+)增殖的影响

目的研究氯离子通道CLC-3反义核苷酸及三苯氧胺对乳腺癌MCF-7细胞株增值的影响,探讨其在乳腺癌治疗方面的生物学基础,为临床乳腺癌的内分泌治疗及生物治疗提供参考。方法将MCF-7细胞分成如下6组,对照组(control group);实验组1:CLC-3反义核苷酸;实验组2:TAM 10μM;实验组3:TAM 20μM;实验组4:CLC-3反义核苷酸+TAM 10μM;实验组5:CLC-3反义核苷酸+TAM 20μM。单纯给予TAM时,于给药后24h收集细胞,以MTT比色法分析。结果随着TAM浓度从0逐渐增加到25μM,MCF-7细胞较对照组的增殖抑制率逐渐增加,呈剂量依赖性。0-10(P<0.05),10-20μM(P<0.01),单纯用反义链阻断CLC-3时MCF-7细胞的增殖没有明显受到抑制。CLC-3反义核苷酸+TAM 10μM与对照组相比有差异(P<0.05);CLC-3反义核苷酸+TAM 20μM较对照组相比有明显差异(P<0.01)。CLC-3反义核苷酸+TAM 10μM与TAM 10μM对比两组之间有差异(P<0.05);CLC-3反义核苷酸+TAM20μM与TAM 20μM对比两组之间有明显差异(P<0.01)。结论 TAM有抑制乳腺癌细胞株MCF-7增殖的作用,CLC-3反义核苷酸可以增加这种作用,且随TAM的浓度增加两者之间的协同作用增大。为临床乳腺癌的内分泌治疗及生物治疗提供了参考。

ClC-3在大鼠异位心脏移植急性排斥期表达的研究

目的:观察氯离子通道ClC-3在大鼠异位心脏移植急性排斥期的表达及其意义。方法:建立大鼠腹部心脏异位移植模型,分对照组及环孢菌素(CsA)组,每组32只。分别灌胃给予生理盐水及CsA干预,每组8只用于观察移植心存活时间,术后1,3,5,7d各6只动态切取标本,常规组织切片监测排斥反应,TUNEL法检测心肌细胞凋亡,免疫组织化法检测Bcl-2和Bax表达的计算机图像定量分析,RT-PCR检测移植心肌组织Clc-3mRNA的表达。结果:CsA组移植心存活时间(15.4±5.1)d,长于对照组(7.6±1.5)d(P<0.01);对照组心肌细胞凋亡指数及Bax的表达强度明显高于CsA组,而Clc-3mRNA的表达显著低于CsA组。结论:移植心脏中Clc-3mRNA表达水平的高低与心脏免疫排斥反应的轻重、心肌细胞凋亡指数及Bax表达的高低密切相关,提示ClC-3在移植心脏免疫排斥反应心肌细胞凋亡中可能起着重要的调解作用。

CLC-3 siRNA对人肺动脉平滑肌细胞增殖及细胞周期的影响

目的探讨CLC-3siRNA对人肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖及细胞周期的影响。方法应用脂质体3000将CLC-3siRNA转入PASMC。通过免疫印记法测定了CLC-3siRNA干扰后PASMC的CLC-3表达水平;应用台盼蓝染色计数法计数了细胞增殖;流式细胞仪测定了细胞周期。结果(1)CLC-3siRNA可降低PASMC的CLC-3表达;(2)CLC-3siRNA干扰可显著抑制PASMC增殖,与空白对照、阴性对照siRNA转染组相比P<0.05;(3)CLC-3siRNA干扰可显著减少PASMC的S期细胞、增加G1期细胞,与空白对照、阴性对照siRNA转染组相比P<0.05。结论 CLC-3siRNA干扰PASMC表达CLC-3,可抑制PASMC的增殖并影响其细胞周期进程。

ClC-3、BK型离子通道与胶质瘤的侵袭性生长关系

目的观察ClC-3与BK离子通道在大鼠胶质瘤细胞中的表达,推测ClC-3与BK在胶质瘤细胞侵袭性生长中的作用。方法常规建立Wistar大鼠C6脑胶质瘤模型,随机分为5组(荷瘤模型组、荷瘤模型+ ClC-3阻断剂Chlorotoxin组、荷瘤模型+BK阻断剂Iberiotoxin组、假手术组及空白对照组),免疫组织化学技术检测ClC-3与BK在荷瘤动物模型中的表达情况,并进一步观察荷瘤动物在分别给予相应离子通道特异性阻滞剂后各个时间点(7、14、21 d)成瘤体积的变化情况。结果C6胶质瘤系高度表达ClC-3离子通道,而BK离子通道在该系中的表达相对较低;应用Chlorotoxin后荷瘤动物各个时间点成瘤体积与对照组相比显著降低(P<0.05),而应用Iberiotoxin后荷瘤动物的成瘤体积与对照组相比无显著变化(P>0.05)。结论 ClC-3离子通道在胶质瘤侵袭性生长发挥重要作用,可作为未来治疗胶质瘤的新靶标。

黄芪甲苷干预高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤的实验研究

目的探究ClC-3氯离子通道在高糖诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤中的分子作用以及黄芪甲苷的干预作用及其机制。方法首先构建高糖诱导HUVECs损伤模型,检测细胞内氯离子浓度,观察ClC-3氯离子通道在此过程中的作用;同时给予不同浓度的黄芪甲苷进行预处理,对细胞的损伤和活力状况进行评估,并对细胞分泌的一氧化氮(NO)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和乳酸脱氢酶(LDH)、ClC-3氯离子通道表达水平、细胞内氯离子浓度等指标进行检测,从而确定黄芪甲苷对高糖导致的HUVECs损伤的改善作用及其可能的分子机制。结果高糖成功诱导HUVECs损伤模型,MTT显示高糖导致HUVECs损伤,应用黄芪甲苷预处理可以有效缓解损伤严重程度,改善细胞活力;高糖损伤HUVECs后细胞内氯离子有明显降低,而黄芪甲苷预处理能够增加ClC-3氯离子通道的mRNA和蛋白表达水平。结论黄芪甲苷能够通过ClC-3氯离子通道降低高糖诱导的HUVECs损伤;高糖诱导的HUVECs损伤过程中有胞内氯离子的外流;黄芪甲苷能够增加ClC-3氯离子通道的表达,并增加细胞内氯离子浓度;黄芪甲苷可能通过ClC-3氯离子通道降低高糖诱导的HUVECs损伤。