细胞源猪瘟活疫苗E2基因遗传稳定性和免疫原性分析

测定了中国4个细胞源猪瘟活疫苗(C株)E2基因全序列,将其与GenBank上13个猪瘟病毒的E2基因序列(含C株原始毒株、7个猪瘟病毒C株以及国际上5个主要猪瘟活疫苗毒株的E2基因全序列)进行了核苷酸序列、推导的氨基酸序列进行遗传变异分析,通过生物信息学手段对预测的E2蛋白N-糖基化位点、E2蛋白磷酸化位点和理化特性以及模拟的蛋白空间结构进行了比较,并通过免疫攻毒试验对4个细胞源猪瘟疫苗(C株)的免疫效果进行了验证。结果表明,与猪瘟病毒C株原始种毒相比,尽管中国4个细胞源猪瘟活疫苗的E2基因核苷酸序列、推导的E2蛋白氨基酸序列或模拟的三维结构等发生个别核苷酸变异、个别氨基酸位点突变或缺失,但均不影响猪瘟C株的免疫原性,猪瘟疫苗C株仍然是防控猪瘟的最有效武器。

猪瘟活疫苗(脾淋源)污染外源性兔出血症病毒的检测与启示

在进行2批猪瘟活疫苗(脾淋源)效力检验时,出现效力检验家兔突然死亡现象,为了查明家兔死亡原因,采用无菌检验、支原体检验、血凝试验、兔体中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)对疫苗或注苗后死亡家兔肝脏、脾脏混合病料进行了检测。结果显示,疫苗的无菌检验、支原体检验结果均为阴性;疫苗及注射疫苗死亡家兔肝脏、脾脏混合病料具有较低的血凝价,血凝试验结果均为可疑;在兔体中和试验中,中和组家兔2/2健康存活,未中和的疫苗对照组家兔2/2死亡;疫苗及注射疫苗死亡后家兔肝脏、脾脏混合病料的ELISA检测结果均为阳性。检测结果证实疫苗中含有兔出血症病毒(Rabbit Haemorrhagic Disease Virus,RHDV)。猪瘟活疫苗(脾淋源)污染RHDV的现象启示:应该加强猪瘟活疫苗(脾淋源)抗原制备过程的控制;同时有必要对猪瘟活疫苗(脾淋源)质量标准进行修订使之进一步补充完善。

我国猪瘟流行新特点与疫苗免疫研究

对我国的猪瘟流行的新特点进行了描述,详细分析了造成猪瘟疫苗免疫失败的6大原因,并且对疫苗的发展历史和研究进展进行了详细介绍,提出了猪瘟防控的两个关键环节为种猪群野毒感染的控制及有效的免疫接种。

猪睾丸(ST)细胞系作为猪瘟活疫苗生产用细胞基质的研究

为评估猪睾丸(ST)细胞系作为猪瘟活疫苗生产用细胞基质的可行性,本试验取猪睾丸(ST)基础细胞库、工作细胞库不同代次细胞分别进行致瘤性检验和胞核学检验。结果表明,ST细胞在传代过程中无致瘤性且染色体遗传稳定。本试验取不同代次的ST细胞繁殖猪瘟病毒液并测定其毒液效价;取不同代次的ST细胞繁殖的猪瘟病毒分别对猪进行免疫攻毒测定其免疫原性。结果表明,将ST工作细胞传至第30代,其仍能良好地表达猪瘟病毒,且产毒稳定,病毒滴度高,连续收毒,病毒产量高,其所表达的猪瘟病毒仍保持良好的免疫原性。上述结果表明,猪睾丸(ST)细胞系适宜作为猪瘟活疫苗生产用的细胞基质。

猪瘟活疫苗(传代细胞源)免疫产生期和免疫持续期试验

将三批猪瘟活疫苗(传代细胞源)以单剂量分别接种仔猪进行免疫产生期试验。在免疫同时以及免后1、2、3、4、5日连同对照组分别攻击猪瘟强毒,攻毒后观察16天,结果表明,猪瘟活疫苗(传代细胞源)免后4日即可产生坚强的免疫保护力。将三批猪瘟活疫苗(传代细胞源)以单剂量分别接种仔猪进行免疫持续期试验。在免后3个月、6个月、9个月、12个月、15个月连同对照组分别攻击猪瘟强毒,攻毒后观察16天,结果表明,猪瘟活疫苗(传代细胞源)的免疫持续期可长达15个月。

猪瘟活疫苗(兔源)免疫猪体后血液转录组学变化初探

为了研究猪瘟活疫苗(兔源)免疫猪体后的免疫应答,本试验选择未免疫猪瘟疫苗且猪瘟抗原抗体阴性的4周龄小猪10头,随机分成2个组别,分别免疫猪瘟活疫苗(兔源)、健康家兔脾淋组织(组织对照),采集免疫后3 d的前腔静脉血液样本,利用RNA-Seq技术进行转录组测序分析,并采用荧光定量PCR(RT-qPCR)方法验证。结果表明:猪瘟活疫苗(兔源)免疫组与脾淋组织对照组相比,外周血中差异表达基因有317个(P<0.05),其中上调表达的基因数量为221个,下调表达的有96个;差异基因GO功能富集分析显示,与生物过程相关的有483个,细胞组分相关的98个,分子功能相关的有87个,其中显著差异转录的mRNA主要参与对病毒的防御反应(defense response to virus)、病毒过程(viral process)等生物过程;KEGG信号通路富集分析表明,涉及的通路数量有215个,与免疫和抗炎相关的有甲型流感(Influenza A)、EB病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、RIG-I样受体(RIG-I-like receptor signaling pathway)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、NOD-like受体信号通路(NOD-like receptor signaling pathway)等,其中CXCL10、RSAD2、OAS1、OAS2、MX1、ISG15等基因上调表达;随机筛选了CXCL10、NOS3、CD86、NOD14个差异表达基因进行RT-qPCR验证,结果显示RT-qPCR和测序结果间的差异表达基因趋势基本一致,说明猪瘟活疫苗(兔源)免疫3 d可刺激猪体先天性免疫应答。

间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗效价方法的建立

为了寻找到猪瘟活疫苗(传代细胞源)效力检验的实验室替代方法,本研究将检验合格的疫苗按头份用专用稀释液10倍梯度稀释后,接种至长满猪睾丸细胞(ST细胞)单层的细胞板上,以猪瘟阳性血清为一抗、山羊抗猪IgG(FITC标记)为二抗,通过反应体系条件的优化,确定病毒接种细胞后培养72 h,一抗和二抗的稀释度为1∶400倍,建立了猪瘟活疫苗(传代细胞源)成品苗的间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)检测方法;此方法敏感性、特异性和重复性良好。用建立的IFA方法检测10批次猪瘟活疫苗(传代细胞源)试验苗,结果为:104.67~105.33TCID50/头份。该方法的建立可为猪瘟活疫苗(传代细胞源)的质量控制提供技术支持和检验参考。

高效制备霍乱弧菌菌影及其增强猪瘟疫苗免疫效果的研究

为评价霍乱弧菌菌影(VCG)对猪瘟活疫苗及猪瘟病毒E2蛋白抗原区(BC和AD区)亚单位疫苗免疫增强效果的作用,本实验首先利用含有裂解质粒的霍乱弧菌制备VCG,通过对细菌裂解前后进行平板计数及透射电镜检测VCG裂解效果,结果显示所制备的VCG裂解率高,且基本形成一个完整的细菌空壳。在确定最佳猪瘟活疫苗使用量后探究VCG对猪瘟活疫苗(CFS ST)免疫效果的影响,实验分别用VCG+CFS ST和CFS ST免疫家兔一次,设置对照组,并在免疫第42 d后攻毒。本研究还探究了VCG作为佐剂对猪瘟E2蛋白主要抗原区蛋白亚单位疫苗免疫效果的影响,实验分别用完全弗氏佐剂(CFA)和VCG联合E2蛋白主要抗原区蛋白,通过间隔两周的方式分4次免疫家兔,设置对照组,并在免疫第56 d后攻毒。通过阻断ELISA方法每周检测家兔血清的抗体阻断率,免疫后以500 RID50的猪瘟病毒弱毒株通过耳缘静脉注射方式对家兔攻毒。结果显示,50 RID50的猪瘟活疫苗组家兔血清抗体阻断率显著降低(p<0.001);VCG+CFS ST组家兔猪瘟抗体阻断率在免疫14 d后大部分时间点显著高于CFS ST组(p<0.05),并且攻毒后仅对照组出现定型热反应;CFA(E2)组和VCG(E2)组的家兔猪瘟抗体阻断率均显著达到较高水平(p<0.001),并且攻毒后仅对照组出现定型热反应。以上结果表明VCG可作为免疫佐剂增强猪瘟活疫苗的免疫效果;VCG联合猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区亚单位疫苗在家兔中也具有较好的免疫效果。本研究为研发廉价高效的疫苗佐剂提供重要的实验依据。

猪瘟脾淋苗免疫仔猪9 d外周血细胞转录谱分析

目的:分析猪瘟脾淋苗免疫仔猪9 d的外周血细胞转录组数据,完善猪瘟脾淋苗免疫机理研究。方法:采集免疫猪瘟脾淋苗9 d小猪(5头)的外周血细胞进行转录组测序分析,并以脾淋组织免疫为对照(5头)。结果:猪瘟脾淋苗组与脾淋组织对照组相比,差异表达的基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)有17 382个,显著差异的DEGs有605个(P<0.05),其中上调的有294个,下调的有311个;将DEGs进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能富集分析,发现免疫后9 d,富集的条目有1 044个,与生物过程相关的有749个,其中酰胺生物合成过程、细胞酰胺代谢过程、翻译等23个过程显著富集(Q<0.05);与细胞组分相关的有145个,其中胞质核糖体、核糖体亚基、核糖体等15个组分显著富集(Q<0.05);与分子功能相关的有150个,核糖体结构成分、结构分子活性、RNA结合3个功能显著富集(Q<0.05);DEGs在京都基因与基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)中富集的信号通路数量有263个,差异显著的通路有10个(P<0.05),包含核糖体、生热作用、一磷酸腺苷活化蛋白激酶信号通路等。结论:本研究提供了猪瘟脾淋苗免疫仔猪9 d的外周血细胞转录组谱,猪瘟脾淋苗可激活外周血细胞核糖体等信号通路,促进蛋白质生物合成。

荧光抗体病毒中和方法检测猪瘟抗体

猪瘟是影响养猪业发展的重要疫病,预防该病最经济的手段是接种疫苗。疫苗免疫猪体后,采血检测抗体水平是评价免疫效果的重要指标之一。本试验将猪瘟活疫苗(兔源)免疫13头4周龄健康小猪,分别采集一免7 d、13 d、24 d、34 d及二免10 d、20 d六个时间点的前腔静脉血,以荧光抗体病毒中和方法检测中和抗体水平。结果发现:在一免7 d,免疫组所有小猪血液中均可检测到具有中和活性的荧光抗体,说明猪瘟活疫苗(兔源)可在短时间内刺激猪体产生体液免疫应答,二免10 d的抗体水平相对于一免34 d略有下降,之后快速上升,二免后20 d,中和抗体水平极显著高于一免后13 d(P<0.01),说明二次免疫猪瘟活疫苗(兔源)可显著提升猪瘟抗体水平。