小鼠抗人密封蛋白18剪接变异体2(Claudin18.2)CAR-T细胞的构建及体外功能验证

目的筛选一种抗人密封蛋白18剪接变异体2(Claudin18.2)的单克隆抗体(mAb),并基于该抗体序列构建靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞,用于开发CAR-T细胞疗法。方法用人Claudin18.2抗原免疫小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,经筛选获得小鼠抗人Claudin18.2 mAb。以抗体序列为模板PCR扩增出重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列,用接头(linker)连接成单链抗体(scFv),并用此scFv构建CAR。将CAR克隆至慢病毒表达载体中,用包装好的慢病毒感染T细胞制备出抗Claudin18.2 CAR-T细胞。结果筛选到的小鼠抗人Claudin18.2 mAb对人和鼠的Claudin18.2抗原都有结合能力,亲和力高于对照抗体。构建的CAR-T细胞在效靶比1∶9时,对过表达Claudin18.2的阳性靶细胞的杀伤率在50%~70%。结论制备的小鼠抗人Claudin18.2 mAb具有人鼠双种属特异性,组织特异性良好,亲和力高。构建的anti-Claudin18.2 CAR-T细胞对靶细胞具有良好杀伤效果。

胆总管结石合并胆管细胞癌患者手术前后HER2、Claudin18表达差异性及其与胆管疾病相关性和对预后的影响

目的探索人表皮生长因子受体(HER)2和闭合蛋白(Claudin)-18在胆总管结石合并胆管细胞癌患者手术前后表达差异性及其与胆管疾病相关性和对预后的影响。方法选取接受肿瘤手术治疗的胆总管结石合并胆管细胞癌患者50例为胆管癌组,单纯胆总管结石患者50例为胆总管结石组,同期体检健康者50例为健康组。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测术前和术后1 w外周血HER2和Claudin-18的水平。收集胆总管结石合并胆管细胞癌患者术中癌组织和癌旁组织样本及胆总管结石患者的胆管组织,采用免疫组化法检测组织中HER2和Claudin-18的表达。将胆管细胞癌患者组织中HER2、Claudin-18表达与临床病理进行相关性分析,治疗后随访3年,记录生存时间,进行生存分析。结果术前及术后胆管细胞癌患者血HER2和Claudin-18表达水平显著高于胆总管结石患者和健康者,术后胆管细胞癌患者血清HER2和Claudin-18表达显著低于术前表达(P<0.05)。胆管细胞癌患者癌组织中HER2和Claudin-18阳性率显著高于癌旁组织及胆管组织(P<0.05);胆总管结石患者胆管组织中HER2和Claudin-18阳性率与癌旁组织无显著差异(P>0.05)。HER2、Claudin18在胆管细胞癌患者中表达水平与组织性分级、血管亲润程度、转移程度呈正相关,与细胞分化程度负相关(均P<0.05);高表达HER2、Claudin18在胆管细胞癌患者的生存时间明显低于低表达患者(P<0.05)。不同分化程度的胆管细胞癌组织中HER2、Claudin-18低、中、高分化表达依次降低,且有统计学差异(P<0.05)。Logistic回归分析显示,HER2、Claudin-18是胆管细胞癌发病的危险因素(P<0.05);受试者工作特征(ROC)曲线分析显示,HER2、Claudin-18曲线下面积分别为0.874(0.794~0.954)、0.977(0.970~0.984),具有很高的检测灵敏度(P<0.05)。结论HER2、Claudin-18、胆总管结石与胆管细胞癌患者发生发展有关并可能成为其临床预后的预测指标。

Claudin 18在胰腺癌细胞中的表达

目的:检测人胰腺癌细胞中Claudin 18的表达,为临床诊断胰腺癌提供新的标志物和治疗靶位。方法:采用RT-PCR、免疫印迹和流式细胞术分别从基因、蛋白和细胞整体水平上检测胰腺导管腺癌和胰岛细胞癌细胞表面人源性Claudin 18的mRNA转录和蛋白的表达。结果:胰腺导管腺癌PANC-1、BX-PC-3和AS-PC-1细胞均可以在mRNA、蛋白和细胞整体的不同水平表达Claudin 18;而胰岛细胞癌RINm5F细胞则不表达Claudin 18。同时,对照细胞胃印戒细胞癌KATOIII也可以大量表达Claudin 18。结论:多数胰腺导管腺癌细胞系均可以在不同水平表达Claudin 18,而胰岛细胞癌细胞系则不能表达Claudin 18,该结果与前期胰腺癌患者的免疫组化检测结果一致。