番茄细菌性溃疡病研究进展

根据国内外近年来番茄溃疡病的研究概况,对番茄溃疡病的历史、主要症状、病原菌的分类地位及生物学特性、病原菌的分离、检测和鉴定技术、病害的田间发生、流行条件及防治方法进行了综述,分析了我国加入世界贸易组织后实施《卫生与植物卫生措施协定》以及农产品安全条例等,认为做好番茄溃疡病风险性分析、监测国际种子贸易传入该病害的可能性非常重要,同时提出了今后加强番茄溃疡病研究的主要方向。

番茄溃疡病菌分子检测技术

对中国三类检疫性有害生物番茄溃疡病菌(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)进行PCR检测方法的研究。利用1对特异性引物ClaF1ClaR2,对5个番茄溃疡病菌进行特异性扩增,得到了一段长250bp的PCR产物,参试的其他棒形细菌以及其他属的植物病原细菌均无扩增产物。该检测方法特异性强、灵敏度高,在50pg的模板DNA浓度下还能检测到很强的条带。利用此引物可以检测到1×105个菌体。

基于锁式探针的番茄溃疡病菌实时荧光PCR快速检测

【目的】从口岸进境番茄种子中检测番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,CMM),一直以来都受检测周期的限制,快速、特异地从种子中检测该病原细菌需要新的方法。研究在锁式探针扩增方式上,选择连接酶依赖的PCR扩增方式,并结合实时荧光PCR技术,旨在建立番茄溃疡病菌基于锁式探针技术的实时荧光PCR快速检测方法,为口岸番茄种子快速检疫提供技术支持。【方法】根据番茄溃疡病菌的一段特异基因Pat-1序列,设计锁式探针的T1和T2臂,使之与CMM的特异性片段碱基序列互补,再按照锁式探针的设计原则设计锁式探针和扩增引物以及荧光探针。试验时,先将锁式探针与CMM以及参照菌株的DNA模板在DNA连接酶作用下分别进行环化连接,再用核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ消化未环化的线性锁式探针,最后以环化的锁式探针为模板,在扩增引物的作用下进行实时荧光PCR试验。建立CMM基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法,分别比较该方法的特异性和灵敏度与常规PCR方法的差异,并用该方法对收集的来自日本、韩国和中国台湾的番茄种子以及国内采集的共45份样品进行检测。【结果】基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出CMM,在供试的10种菌株中,只有靶标细菌能被特异性地检测到阳性,空白对照和其他参试菌株均没有荧光信号的增加,检测为阴性。比较该检测方法与常规PCR方法,其特异性和常规PCR方法一致。该检测方法检测灵敏度高,DNA最低浓度检测为50 fg·μL-1,而常规PCR方法检测DNA最低浓度为5 pg·μL-1,灵敏度高于常规PCR两个数量级。对收集的样品进行检测,结果显示,45份样品中共有5份样品CMM检测结果为阳性,分别是日本的番茄种子样品2份(编号Jap1214、Jap1102),永泰采集的样品2份(编号为Yongt1001、Yongt1002)和闽清采集的样品1份(编号为Minq1001)。【结论】建立的基于锁式探针技术的荧光PCR方法具有高度的特异性和灵敏度,应用该检测方法对收集的进境番茄种子进行检测,可以直接从番茄种子中检测到CMM,该方法适合口岸番茄种子CMM的快速检测,有较好的口岸检疫实际应用价值。

苜蓿萎蔫病菌Taq Man探针实时荧光PCR检测方法的建立

苜蓿萎蔫病菌是我国对外检疫性二类有害生物 ,目前国内尚无发生。在出入境检验检疫中主要是采用生物学和血清学方法进行检测 ,劳动强度大 ,耗费时间长。根据苜蓿萎蔫病菌与其它细菌菌株 1 6SrDNA序列差异 ,设计出对苜蓿萎蔫病菌具有稳定点突变特异性探针 ,利用该探针对棒形杆菌属 4个种及其它属细菌进行了实时荧光PCR检测实验。结果表明 ,只有苜蓿萎蔫病菌能检测到荧光信号 ,其它细菌没有荧光产生。该方法特异性强 ,灵敏度高 ,能检测到 2 1 4fg质粒DNA ,比常规PCR灵敏 1 0 0倍 ,而且整个过程只需要 2～ 3h。该方法可有效地应用于进出境病原菌检测之中。

双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌方法的建立

【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)和黑胫病菌(Pectobacterium atroseptica)。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达100 fg.μL-1,在细菌数上达105CFU.mL-1。利用双重PCR体系对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌进行扩增,可获得913和690 bp的2条特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达600 fg.μL-1,在细菌数上达5×105 CFU.mL-1。【结论】成功建立了双重PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系,该技术能够同时快速可靠地检测出马铃薯环腐病菌和黑胫病菌。

番茄溃疡病菌实时荧光PCR快速检测方法研究

根据番茄溃疡病菌ITS(16S^23SrDNA间隔区)基因序列,设计并合成了荧光PCR检测引物(Fan1和Fan2)及特异性检测探针(Fanprobe),对番茄溃疡病菌和非番茄溃疡病菌的标准菌株实时荧光PCR反应。结果表明,番茄溃疡病菌PCR产物出现强烈的特异杂交信号,而非番茄溃疡病菌均未出现特异荧光信号,证明这对引物及探针具有番茄溃疡病菌鉴定特异性。将番茄溃疡病菌DNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果表明,此体系可检出52.3 fg/μL的模板。

双重PCR检测马铃薯晚疫病和环腐病方法的建立

通过克隆马铃薯环腐病菌和晚疫病菌转录间隔区(ITS)序列,并对测序结果进行同源性比较,选取差异位点分别设计了两对引物P.IN1/P.IN2和C.IN1/C.IN2,并检测了引物的特异性及方法的灵敏度。引物P.IN1/P.IN2可扩增出1条363bp马铃薯晚疫病菌的特异性条带,在DNA水平上其灵敏度达18fg/μL;引物C.IN1/C.IN2可扩增出1条218bp马铃薯环腐病菌的特异性条带,在细菌数上检测灵敏度为104 cfu/mL。混合这两对引物构建双重PCR反应体系,能从马铃薯环腐病菌和晚疫病菌的混合DNA及感染这两种菌的马铃薯植株中同时扩增到363bp和218bp的特异片段。实现了同时对马铃薯晚疫病菌和环腐病菌的快速可靠检测。

新疆加工番茄溃疡病的发生及其病原菌研究

【目的】番茄溃疡病是番茄上最严重、最具毁灭性的病害之一，2010年6～8月在新疆石河子、奎屯等地的加工番茄田间相继发现典型症状的病株和病果。旨在明确引起该病害的主要病原菌种类，为进一步的防治研究打好基础。【方法】对采集的病株、病果进行病原菌的分离纯化，应用注射法、剪叶法及喷雾接种测定菌株的致病性；通过供试菌株的形态学特征、培养特性、生理生化反应的测定、16SrDNA序列分析及番茄溃疡病菌特异性引物的PCR检测确定病原的归属。【结果】所有供试菌株对供试番茄都具有致病性，表现为茎秆爆裂，植株萎蔫死亡。菌株形态特征、培养特性及生理生化反应都与密执安棒形杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganense subsp．michiganense）的特征相一致；供试菌株16SrDNA核苷酸序列与德国已报道的密执安棒形杆菌密执安亚种菌株的核苷酸序列同源性为99．86％；特异性引物检测也得到预期目标片段。【结论】因此，将此病害确定为番茄溃疡病，其病原为密执安棒形杆菌密执安亚种（ C. michiganensis subsp. Michiganensis ）。

番茄溃疡病菌LAMP快速检测方法的建立

以SYBR Green I为指示剂,建立了番茄溃疡病菌的环介导等温扩增可视化快速检测方法。根据番茄溃疡病菌特异的核糖体转录间隔区序列设计了4条引物进行LAMP扩增,通过对体系中各成分进行优化,最终确定25μL反应体系中模板200ng,MgSO4的适宜浓度为3.0mmol/L,Bst DNA聚合酶2U,dNTPs的适宜浓度为0.3mmol/L,外引物与内引物之比为1∶3时扩增效果较好,在65℃最佳反应时间为40min。在优化的体系条件下,获得的反应产物经SYBR Green I染色后,肉眼观察检测灵敏度可达到50CFU/mL,且对番茄溃疡病菌的检测具有高度的特异性。结果表明,该方法快速、准确、灵敏、特异,具有良好的实用性。

马铃薯环腐病菌LAMP检测方法的建立

选择马铃薯环腐病菌(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)基因组DNA特有的保守区域(pCSL0067)设计一套LAMP引物,通过优化反应条件,建立了马铃薯环腐病菌LAMP检测体系。利用多种参比菌的DNA为模板对LAMP检测体系特异性进行了验证,利用马铃薯环腐病菌DNA溶液和菌液梯度稀释液对LAMP检测体系的检测灵敏度进行了验证。在特异性试验中,LAMP检测体系仅对马铃薯环腐病菌进行扩增,对非靶标菌不产生扩增。LAMP检测体系DNA和菌体检测灵敏度分别达到了0.527×10-3 ng/uL和150 CFU/mL。为马铃薯环腐病菌的检测提供了一种新的、简便、快速的检测手段。

利用Bio-real-time PCR技术检测玉米内州萎蔫病菌

玉米内州萎蔫病是北美玉米生产上的严重病害之一,为预防其传入我国,利用人工注射接种的方法模拟自然感病的玉米籽粒,通过Clavibacter michiganensis不同亚种的转录间隔区序列,设计了特异性的TaqMan-MGB探针,将Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis(Cmn)的半选择性培养基sCNS和特异性的探针结合,建立了进出境玉米种子上Cmn的Bio-real-time PCR检测方法,该方法可以检测到105粒玉米种子中含有一粒感病籽粒(带菌量为1.2×106 CFU/粒)的种子样品,可以应用于实际检测。

纳米磁珠免疫层析法检测玉米内州萎蔫病菌

基于纳米磁珠标记的免疫层析法,建立快速定量灵敏检测玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis,Cmn)的层析试纸条检测方法。用碳二亚胺(EDC)/N-羧基琥珀酰亚胺(NHS)交联法,使玉米内州萎蔫病菌单抗4G12偶联在纳米磁珠表面上,使用喷膜仪将玉米内州萎蔫病菌单抗4H4和羊抗小鼠IgG喷涂于硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,基于双抗夹心法原理建立免疫层析试纸条。通过对检测线上超顺纳米磁珠的磁信号进行检测和结果分析,Cmn抗原最低检测限度为1.0×105 CFU/mL,特异性良好且检测时间缩短为5 min。该方法同时可根据检测线的光学反应进行定性判断,具有操作简便、灵敏度高等优点,并可根据磁信号强度定量检测实际玉米种子样品中Cmn的浓度,为植物病原细菌的快速高效检测提供了一种新型的检测方法。

玉米内州萎蔫病菌的巢式PCR检测方法

目的建立了一种特异、敏感、快速的玉米内州萎蔫病菌的巢式PCR(Nest-PCR)检测方法。方法根据玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.Nebraskensis,Cmn)和C.michganensis种下其他4个亚种细菌Cmm、Cmi、Cms、Cmt的ITS序列差异性基因位点设计Cmn FP-OUTER/Cmn RP-OUTER为外侧引物,Cmn FP-INNER/Cmn RP-INNER为内侧引物的巢式-PCR,并对所有参试菌株DNA和菌悬液进行了扩增。结果经过两轮扩增,能从参试的玉米内州萎蔫病菌中特异性地扩增出1条122 bp的片段,而其他参试菌株没有扩增信号。该巢式PCR检测方法对菌悬液的最低检测限为3.54×102 CFU/m L,检测灵敏度比常规PCR提高了1000倍。结论本研究建立的玉米内州萎蔫病菌的巢式PCR(nest-PCR)检测方法具有良好的特异性和灵敏性,将会在玉米内州萎蔫病的早期诊断及预防传入方面发挥重要作用。

PCR技术快速检测玉米内州萎蔫病菌研究

玉米内州萎蔫病是北美玉米生产中的严重病害,为防止其传入我国,本研究采用Clavibacter michiganensis不同亚种的转录间隔区序列,设计了特异性的PCR引物,对C.michiganensis种下不同亚种的DNA进行了PCR扩增反应,结果表明,只有玉米内州萎蔫病菌的特异性扩增得到大小为170bp的目标片段,且仅有此一条明显的PCR扩增产物,C.michganensis种下其他亚种无扩增产物。PCR反应的灵敏度为4.36×105cfu/mL和1.56×102pg,可以满足检疫的要求。

苜蓿细菌性萎蔫病菌16S rDNA片段的克隆及序列分析(简报)

利用细菌16S rDNA保守序列通用引物对16sF/16sR对苜蓿细菌性萎蔫病菌的标准菌株(IPQ0019)总DNA进行扩增,得到了大约1.5 kb的片段。将此片段插入到pGEM-T载体并转化进大肠杆菌DH5α菌株中,经PCR鉴定、限制性内切酶分析及核苷酸序列同源性分析均表明克隆成功。该研究为制备苜蓿细菌性萎蔫病菌的DNA分子探针奠定了基础。

番茄溃疡病菌的环介导等温核酸扩增技术检测方法

目的建立番茄溃疡病菌的环介导等温核酸扩增技术检测方法。方法应用环介导等温核酸扩增技术(LAMP)对番茄溃疡病菌的16SrRNA特异性基因进行扩增,采用4对引物识别目的片段的6个特异性区域,62℃恒温1h完成扩增。结果设计的引物与对照菌皱纹假单胞菌、茄假单胞菌、丁香假单胞菌番茄致病变种都没有扩增反应,表现了较好的特异性。这些对照菌在茄科蔬菜上易引起类似症状。结论 LAMP检测程序便捷,所需设备简单,其结果可以通过肉眼观察来判断,比常规PCR灵敏且能更早得到反应结果,因此该技术具有更大的优势。

EMA-qPCR方法快速检测番茄溃疡病菌活菌研究

将叠氮溴乙锭(EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合(EMA-q PCR),建立一种有效快速检测番茄溃疡病活菌的方法。以番茄溃疡病菌Pat-1基因为检测靶标,菌体经EMA渗透处理,再进行q PCR特异性扩增。结果显示,q PCR检测灵敏度为1.0×101CFU/m L;当EMA的浓度为2.0μg/m L时,能有效抑制1.0×107CFU/m L灭活死菌的扩增,对活菌的扩增没有影响。当活菌数在1.0×101~1.0×105CFU内,每个q PCR反应体系中活菌CFU数与Ct值呈线性相关(R2=0.987)。不同温度处理后EMA-q PCR检测番茄溃疡病菌的存活情况并与平板计数法进行比较,表明待检样品可在4和20℃短期保存。对疑似带病番茄种子样品进行EMA-q PCR检测,发现EMA-q PCR方法能减少番茄溃疡病菌PCR检测的假阳性结果。本研究建立的EMA-q PCR方法是一种能有效检测番茄溃疡病活菌的方法,并能有效避免PCR检测实际样品可能造成的假阳性结果。

ELISA及实时荧光PCR检测番茄细菌性溃疡病菌的方法比较

本文以番茄细菌性溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp．michiganensis）菌悬液和田间采集的病组织为材料，比较ELISA试剂盒、常规PCR方法和实时荧光PCR方法检测番茄细菌性溃疡病菌灵敏度和适用性。结果表明，ELISA试剂盒检测灵敏度为10^5 cfu／mL，具有简便、快速、易操作特点，适用于田间病害诊断；常规PCR检测灵敏度为10^5cfu／mL；TaqMan探针实时荧光PCR检测灵敏度为10^3-4cfu／mL，比常规PCR和ELISA检测灵敏度提高10—100倍，且不需要琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色和Southern杂交，但需要昂贵的仪器和试剂，适用于室内检测及相关研究。

云南省马铃薯环腐细菌鉴定

报道对云南省陆良县引起马铃薯植株萎蔫和块茎维管束环状腐烂的病原菌从致病性、形态学、培养形状、运动性、生理生化测定等方面进行的鉴定,确定该菌为马铃薯环腐菌(Clavibactermichiganensissubsp.sepedonicus)。

超分支滚环扩增技术快速检测番茄溃疡病菌

根据番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,cmm)的一段特异致病基因pat-1序列,按照锁式探针的设计原理设计探针和扩增引物,优化系列反应条件,建立了特异性的cmm超分支滚环扩增技术。实验结果表明该检测技术能够从供试的10种菌中特异性地检出番茄溃疡病菌,检测灵敏度高,DNA最低检测浓度为500 fg/μL。