甘木通强心苷的提取工艺及抗大鼠心力衰竭作用研究

目的优选甘木通强心苷的提取工艺,测定甘木通中强心苷的含量,研究其抗心力衰竭的作用。方法以强心苷含量以及干膏得率为评价指标,采用正交试验优选甘木通强心苷最佳提取工艺。采用紫外光度法测定不同产地不同部位甘木通的强心苷含量。采用冠状动脉前降支结扎法制备大鼠心力衰竭模型,记录各组大鼠心脏血流动力学指标,测定大鼠血清中醛固酮(ALD)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、N-前端心钠肽(ANP)和N-前端脑钠肽(BNP)的含量,计算心脏指数。结果甘木通强心苷的最佳提取工艺为料液比为1∶20(质量容积比),乙醇浓度85%,提取温度80℃,超声提取30 min。甘木通根、茎、叶部位的强心苷含量分别为0.25~0.43、0.67~0.86、0.41~0.67 mg·g^(-1)。与假手术组比较,模型组左室收缩压(LVSP)、左室内压最大上升速率(+dp/dt_(max))、左室内压最大下降速率(-dp/dt_(max))和心率(HR)显著下降(P<0.05),左室舒张末压(LVEDP)显著升高(P<0.05),大鼠血清中ALD、AngⅡ、ANP和BNP含量明显上升(P<0.05),全心质量指数(HMI)和左心室质量指数(LVMI)明显升高(P<0.05)。与模型组比较,甘木通高、低剂量组和阳性药卡托普利组大鼠LVSP、+dp/dt_(max)、-dp/dt_(max)和HR显著升高(P<0.05),LVEDP则显著降低(P<0.05);血清中ALD、AngⅡ、ANP和BNP含量显著降低(P<0.05),HMI和LVMI明显降低(P<0.05)。结论所优化的工艺适用于甘木通中强心苷的提取,甘木通中强心苷的含量与药材的部位,以及采集的地区、时间有关;甘木通强心苷对慢性心力衰竭大鼠具有保护作用。

甘木通总黄酮对乳鼠原代心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:研究甘木通总黄酮(TFCD)对大鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧复氧(H/R)损伤的保护作用。方法:采用原代培养SD大鼠乳鼠心肌细胞建立H/R损伤模型,实验分为正常组、模型组、TFCD组(75、150、300μg/m L)及地奥心血康阳性药物对照组。采用MTT法测定TFCD对心肌细胞的存活率;Hoechest染色观察细胞核形态变化;比色法测定培养液中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)的含量;荧光法测定细胞内钙离子浓度。结果:TFCD可显著提高H/R损伤心肌细胞内SOD的活性,能显著抑制LDH、CK的活性、MDA的生成以及细胞内钙浓度。结论:TFCD对乳鼠H/R损伤的心肌细胞具有保护作用,其作用机制可能与抗脂质过氧化和减轻细胞内钙超载有关。

甘木通乙酸乙酯提取物对低糖缺氧诱导的神经细胞的保护作用

目的 研究甘木通乙酸乙酯提取物对低糖缺氧诱导神经细胞凋亡的保护作用.方法 PC12细胞结合物理缺氧方式建立缺血性中风的细胞模型,CCK-8检测细胞活性,测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出分析细胞膜完整性,流式细胞术和Hoechst 33258染色检测细胞凋亡,JC-1法测定细胞内线粒体膜电位,Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表达,检测SOD、MDA水平分析甘木通乙酸乙酯提取物的抗氧化能力.结果 与模型组比较,甘木通乙酸乙酯提取物可以有效提高缺氧PC12细胞的存活率(P<0.01),降低LDH漏出量(P<0.01),提高线粒体膜电位,增加细胞内SOD水平,降低MDA水平,增加Bcl-2蛋白表达,减少Bax,cleaved caspase-3蛋白的表达(P<0.05,P<0.01),降低细胞凋亡率.结论 甘木通乙酸乙酯提取物可抑制低糖缺氧诱导PC12细胞凋亡,该神经保护作用可能与细胞的线粒体凋亡途径有关.

甘木通总黄酮对表柔比星心肌毒性的抑制作用及机制研究

目的:研究甘木通总黄酮对表柔比星心肌毒性的抑制作用及机制。方法:从初生SD大鼠分离培养原代心肌细胞,以1.0μmol/L表柔比星建立心肌毒性模型,采用表面活性剂-超声协同方法提取甘木通中总黄酮,设3个药物浓度组,在损伤模型的基础上分别加入终浓度为25、50、100μg/m L的甘木通总黄酮,阳性对照组加入10μmol/L右丙亚胺,各组均作用24 h,采用CCK-8检测细胞存活率,Hoechst33258染色观察细胞的凋亡形态,JC-1荧光探针检测线粒体膜电位变化,Western blot检测凋亡相关信号蛋白Bax、Bcl-2及cleaved Caspase-3的表达量,采用比色法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)的生成量。结果:与模型组比较,甘木通总黄酮各剂量均可显著提高心肌细胞的存活率,降低表柔比星对线粒体的损伤,并可通过降低Bax及上调Bcl-2的表达量抑制cleaved Caspase-3的生成,进而抑制细胞的凋亡(P<0.05);同时能提高SOD的活性,抑制脂质过氧化反应从而降低MDA的生成(P<0.05)。结论:甘木通总黄酮可通过抑制脂质过氧化反应干预细胞凋亡的线粒体通路从而降低表柔比星的心肌毒性。

正交试验法研究甘木通总黄酮的提取条件

目的:用正交试验法考察甘木通总黄酮的最佳提取条件。方法:以芦丁为对照品建立标准曲线方程用于测定甘木通总黄酮含量,以乙醇为溶剂分别考察温度、乙醇浓度、提取时间、药材/溶剂比例及提取次数等因素对甘木通总黄酮提取率的影响,据此设计四因素三水平正交试验,系统考察甘木通总黄酮的最佳提取条件。结果与结论:药材与70%乙醇按照1:20的比例,在90℃回流提取1h共2次,甘木通总黄酮提取率可达93.27%。

甘木通的离体快繁

本研究初步建立快速培养甘木通组培苗的体系。以幼茎段为外植体,最适的诱导愈伤组织的培养基为MS+NAA0 .1mg/L+6 -BA0 .5mg/L(单位下同);不定芽诱导和增殖的培养基为MS+NAA0 .05+6 BA0. 5,壮苗生根培养基为MS+NAA0. 1。经炼苗后,组培苗移栽成活率达78%左右。

甘木通提取物对家兔心肌缺血的保护作用

目的:探讨甘木通提取物对家兔急性心肌缺血的影响。方法:结扎家兔冠状动脉左前降支建立急性心肌缺血模型,40只健康家兔平均分为假手术组、模型组、丹参对照组与甘木通不同剂量组。甘木通组分别给予浓度为100%的甘木通提取液灌胃(剂量分别为1ml/kg和2ml/kg),连续5d,丹参对照组于缺血前从耳缘静脉注射给药(0.2mg/kg)。记录心肌缺血前后标准肢体导联心电图,测定血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、超氧化物歧化酶(SOD)活性与脂质过氧化物丙二醛(MDA)的含量。结果:与模型组相比,甘木通提取物可明显对抗结扎家兔冠状动脉左前降支引起的急性心肌缺血时心电图S-T段的异常偏移及T波抬高,减慢心率;显著降低血清LDH、CK水平及MDA含量和升高SOD水平(P<0.05或P<0.01)。结论:甘木通提取物对家兔急性心肌缺血有明显的保护作用。

甘木通不同部位总黄酮含量的测定

目的:建立黄酮类化合物含量的测定方法并分别测定甘木通茎、叶中总黄酮含量。方法:以芦丁为对照品建立标准曲线,以75%乙醇为溶剂在90℃加热回流提取甘木通茎、叶中总黄酮类成分,用分光光度法在波长510nm处测定总黄酮含量。结果:芦丁浓度(C)与吸光度(A)间的关系为C=0.090244A-0.0001936(r=1.0000),回收率为101.18%,RSD=2.36%(n=5)。甘木通茎和叶中总黄酮含量分别为0.99%和1.20%。结论:甘木通叶中总黄酮含量比茎约高出21%。

甘木通总黄酮保护H_2O_2诱导的PC12细胞损伤

目的探讨甘木通(Clematis filamentosa)总黄酮(TFC)对H_2O_2引起的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)损伤的保护作用。方法用H_2O_2损伤PC12细胞建立神经元氧化应激损伤模型,噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,观察甘木通总黄酮对神经元损伤的作用;形态学以及Hoechst 33258染色观察TFC对细胞形态的影响;生化法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)的量。结果与200μmol/L H_2O_2诱导的模型组对比,中(10μg/m L)、高(100μg/m L)剂量甘木通总黄酮预处理细胞形态好于模型组,细胞活性明显增强(P<0.05),细胞内的SOD活性增强(P<0.05),MDA水平减低(P<0.05)。结论甘木通总黄酮对H_2O_2引起的神经损伤有保护作用。

甘木通中总黄酮的超声提取工艺研究

[目的]用正交试验法优选甘木通中总黄酮的超声提取工艺。[方法]以干浸膏中总黄酮的含量为指标,采用单因素和正交试验确定超声波辅助提取甘木通总黄酮的工艺条件。[结果]提取溶剂量为10倍,乙醇浓度为65%,提取次数为2次,超声提取时间为30min时,提取物中总黄酮含量最高,芦丁在2.72～16.32μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系。[结论]超声提取甘木通中总黄酮的工艺研究结果比较可靠,含量测定方法简便、准确,可用于甘木通干浸膏中总黄酮的含量测定。

甘木通活性化合物的抗氧化活性及对H_(2)O_(2)诱导的H9C2心肌细胞损伤的保护作用

目的研究甘木通中10种活性化合物对H_(2)O_(2)诱导形成的H9C2心肌细胞损伤模型的保护作用。方法采用DPPH法测定甘木通活性化合物对自由基清除活性,铁还原法评价铁还原活性。用甘木通提取物处理H_(2)O_(2)诱导H9C2细胞建立的细胞损伤模型。MTT法测定细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率和ROS水平,Western blot法测定细胞凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、血红素氧合酶-1(HO-1)、半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)表达水平。结果甘木通活性化合物能提高自由基清除活率,增加还原能力,其中木犀草素具有最高的活性。这些化合物对H_(2)O_(2)诱导的H9C2细胞氧化应激具有明显的抑制作用,降低细胞中活性氧的积累,提高抗氧化酶HO-1和GCLC的表达。结论甘木通活性化合物可不同程度改善由H_(2)O_(2)诱导的心肌细胞损伤,发挥心肌细胞保护作用,与其调节氧化应激的作用有关。

甘木通抗心肌缺血的有效部位与作用研究

目的研究甘木通抗心肌缺血的有效部位及抗心肌缺血作用。方法甘木通乙醇提取物被分离成6个组分,记录各组分对结扎家兔冠状动脉左前降支后Ⅱ导联心电图T波与S-T段的影响,筛选出有效组分。然后实验分为假手术组、心肌缺血模型组、甘木通组(高、低剂量)和丹参对照组,记录缺血前后的Ⅱ导联心电图,1 h后,取血测定血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平;另取缺血区心肌检测凋亡细胞及凋亡相关基因Bcl-2与Bax的蛋白表达。结果甘木通乙醇提取物的乙酸乙酯部分能明显改善心肌缺血后Ⅱ导联心电图T波与S-T段的偏移,经定性检测具有黄酮类成分的特性。与模型组比较,甘木通提取物乙酸乙酯部分能明显降低心肌缺血家兔血清CK、LDH和MDA水平和升高SOD水平(P<0.01);显著抑制心肌缺血引起的细胞凋亡,增加Bcl-2和抑制Bax的蛋白表达(P<0.01)。结论甘木通提取物的乙酸乙酯部分是其抗心肌缺血的主要有效部分,具有黄酮类特性,通过提高抗氧化能力和抑制细胞凋亡发挥抗心肌缺血作用。

不同产地甘木通药材多谱图鉴定及质量控制

目的:构建甘木通药材的薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、傅里叶红外光谱(FTIR)、气相色谱-质谱(GC-MS)多谱图体系,控制其质量。方法:采用HPLC法测定药材中的山柰素含量,色谱柱为WatersXbridgeC18(250mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-0.4%冰乙酸水溶液(梯度洗脱),检测波长为326nm;TLC法中甘木通石油醚部位与乙酸乙酯部位的展开剂分别为石油醚-甲醇(9:1)和氯仿-甲醇(9:1);采用FTIR法对石油醚和乙酸乙酯部位的特征吸收峰进行标注;采用GC-MS联用法分析甘木通的挥发油成分。结果:不同产地甘木通药材在TLC、HPLC与IR图中有共性的特征峰用于定性;HPLC测定山柰素含量可用于定量;GC-MS法共鉴定出37个组分。结论:多谱图体系可综合鉴定甘木通药材并用于其质量控制。

甘木通总黄酮抗心肌缺血的作用

目的:研究甘木通总黄酮抗心肌缺血作用。方法:取Wistar大鼠36只,随机分为6组,每组6只,假手术组、模型组、甘木通总黄酮低、中、高剂量组(8,16,32 mg·kg-1)和复方丹参片组(250 mg·kg-1),除假手术组外,其余大鼠采用结扎大鼠冠状动脉前降支制备心肌缺血模型,造模成功后ig给药,观察甘木通总黄酮对大鼠心电图ST段位移、血清心肌酶活力及心肌梗死范围的影响;昆明种小鼠30只,随机分为5组,分别为生理盐水组、甘木通总黄酮低、中、高剂量组(12,24,48 mg·kg-1)和复方丹参片组(360 mg·kg-1),采用小鼠密闭缺氧实验,观察甘木通总黄酮对小鼠耐缺氧存活时间的影响。结果:与假手术组比较,模型对照组心电图ST段即刻出现显著性抬高(P<0.01),血清谷草转氨酶(AST),乳酸脱氢酶(LDH),肌酸肌酶同工酶(CK-MB)活力均显著升高(P<0.01),心肌梗死范围显著升高(P<0.01);与模型组比较,甘木通总黄酮各剂量组均可不同程度地降低急性心肌缺血大鼠不同时间点心电图ST段抬高值(P<0.05),降低血清AST,LDH,CK含量(P<0.05,P<0.01),降低心肌梗死率(P<0.01),并呈现一定的剂量效应;还可显著延长小鼠常压耐缺氧时间(P<0.05)。与复方丹参片组比较均无差异。结论:甘木通总黄酮对心肌缺血具有显著的保护作用。