亲子关系与CLOCK基因rs1801260多态性对学前儿童亲社会行为的交互影响:性别的调节作用

研究探讨了亲子关系与CLOCK基因rs1801260多态性对学前儿童亲社会行为的交互影响及性别的调节作用。以694名学前儿童(M_(年龄)=5.06岁,SD=0.87)及其父母为测试对象,收集儿童的唾液样本进行基因分型,由儿童父母填写亲子关系和儿童亲社会行为量表。研究结果发现,亲子亲密与亲子冲突对亲社会行为的主效应显著。亲子冲突、CLOCK基因rs1801260多态性和性别三重交互影响儿童的亲社会行为,即与携带C等位基因的男孩相比,携带TT基因型的男孩在低亲子冲突下会表现出更多的亲社会行为,在高亲子冲突下则表现出更少的亲社会行为。但亲子冲突与CLOCK基因rs1801260多态性对女孩亲社会行为的交互作用不显著。研究结果为深入理解学前儿童亲社会行为形成的基因-环境交互作用机制提供了证据。

Clock基因多态性与不同发情模式绵羊产羔数的关联分析

本研究旨在探究绵羊Clock基因g.70873128G>A、g.70875941C>T和g.70885750G>T位点多态性与绵羊产羔数之间的关系,以期为绵羊高繁殖力分子育种提供新的遗传标记。利用Sequenom MassARRAY?SNP技术对常年发情绵羊品种(小尾寒羊、湖羊和策勒黑羊)和季节性发情绵羊品种(滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊)Clock基因3个多态位点多态性进行检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联分析。分型结果表明:g.70873128G>A位点存在AA、AG和GG 3种基因型,g.70875941C>T位点存在TT、TC和CC 3种基因型,g.70885750G>T位点存在GG、GT和TT 3种基因型。群体遗传学分析表明:3个位点基因型频率和等位基因频率在2种发情模式绵羊品种间均达到差异极显著水平。g.70873128G>A位点在滩羊和草原型藏羊中表现为中度多态(0.25T位点和g.70885750G>T位点在策勒黑羊和滩羊中表现为中度多态(0.25A位点在策勒黑羊和滩羊中处于哈代-温伯格不平衡状态(P<0.05),g.70875941C>T位点在苏尼特羊中处于哈代-温伯格不平衡状态(P<0.05),g.70885750G>T位点在6个绵羊品种中处于哈代-温伯格平衡状态(P>0.05)。关联分析表明,3个多态位点与小尾寒羊第1、第2以及第3胎产羔数均无显著关联。综上,Clock基因g.70873128G>A、g.70875941C>T和g.70885750G>T位点可能都不是影响小尾寒羊产羔数的关键位点。

异齿裂腹鱼Clock基因cDNA的克隆与组织表达特征

异齿裂腹鱼广布于雅鲁藏布江,产卵期为每年的3—5月,表现出明显的季节性繁殖行为,Clock基因被认为是自然选择塑造日节律以及与动物繁殖等生活史特性有关潜在的目标基因,异齿裂腹鱼Clock蛋白C末端Poly-Q长度的变异可能与其产卵开始的时间关联。以采自雅鲁藏布江的异齿裂腹鱼为对象,采用反转录PCR和cDNA末端快速扩增技术克隆异齿裂腹鱼Clock基因cDNA全长序列,通过实时荧光定量PCR对其在异齿裂腹鱼雌、雄个体不同组织中的表达特征进行分析。试验结果显示:异齿裂腹鱼Clock基因cDNA全长为4291 bp(Genbank登录号MT774361),5′非编码区为539 bp,3′非编码区为1046 bp,编码序列为2706 bp,共编码901个氨基酸,所编码的氨基酸在末端具有典型的Poly-Q结构;Clock基因在异齿裂腹鱼雌、雄个体的肝脏、脾脏、心脏、脑、性腺和肌肉中均有表达,且以性腺中的相对表达量最高,肌肉次之,脾脏最低;Clock基因除在心脏组织中的相对表达量雄鱼高于雌鱼,在其他组织的相对表达量均表现为雌鱼高于雄鱼。异齿裂腹鱼雌、雄个体的Clock基因在性腺组织中均高表达,表明Clock基因在异齿裂腹鱼的繁殖过程中发挥着更大的作用,异齿裂腹鱼Clock蛋白大片段的插入也可能是为了适应高海拔某些条件而特化的。

大鼠视交叉上核与松果体中Clock基因转录的昼夜节律性及不同光反应性(英文)

本研究旨在观察和比较视交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)与松果体(pineal gland,PG)中Clock基因内源性昼夜转录变化规律以及光照对其的影响。Sprague-Dawley大鼠在持续黑暗(constant darkness,DD)和12 h光照：12 h黑暗交替(12 hour- light：12 hour-dark cycle,LD)光制下分别被饲养8周(n=36)和4周(n=36)后,在一昼夜内每隔4 h采集一组SCN和PG组织(n=6),提取总RNA,用竞争性定量RT-PCR测定不同昼夜时点(circadian times,CT or zeitgeber times,ZT)各样品中Clock基因的mRNA相对表达量,通过余弦法和Clock Lab软件获取节律参数,并经振幅检验是否存在昼夜节律性转录变化。结果如下：(1)SCN中Clock基因mRNA的转录在DD光制下呈现昼低夜高节律性振荡变化(P＜0．05),PG中Clock基因的转录也显示相似的内源性节律外观,即峰值出现于主观夜晚(SCN为CT15,PG为CT18),谷值位于主观白天(SCN为CT3,PG为CT6)(P＞0．05)。(2) LD光制下SCN中Clock基因的转录也具有昼夜节律性振荡(P＜0．05),但与其DD光制下节律外观相比,呈现反时相符律变化(P＜0．05),且其表达的振幅及峰值的mRNA水平均增加(P＜0．05),而PG中Clock基因在LD光制下转录的相应节律参数变化却恰恰相反(P＜0．05)。(3)在LD光制下,光照使PG中Clock基因转录的节律外观反时相于SCN(P＜0．05),即在SCN和PG的峰值分别出现于光照期ZT10和黑暗期ZT17,谷值分别位于黑暗期ZT22和光照期ZT5。结果表明,Clock基因的昼夜转录在SCN和PG中存在同步的内源性节律本质,而光导引在这两个中枢核团调节Clock基因昼夜节律性转录方面有着不同的作用。

异钩藤碱对血管平滑肌细胞中Baml1、Clock基因表达的调节作用

目的研究异钩藤碱对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)中时钟基因(Bmal1、Clock)昼夜节律表达变化的调节作用。方法以AngⅡ诱导胸主动脉平滑肌细胞(A7r5细胞)建立节律变化模型。实验分AngⅡ诱导组、异钩藤碱组、正常对照组。AngⅡ诱导组以终浓度为100 nmol.L-1的AngⅡ诱导24 h,异钩藤碱组加入终浓度为100 nmol.L-1的AngⅡ和12 mg.L-1异钩藤碱处理24 h。采用Real-time PCR方法检测不同时间点VSMC中Bmal1、Clock基因表达水平,比较各组之间节律参数的差异。结果异钩藤碱通过调节AngⅡ诱导的A7r5细胞中的Baml1、Clock基因表达,改变其中值、振幅及峰相位,使A7r5昼夜节律发生改变。结论异钩藤碱对A7r5细胞中Baml1、Clock基因的昼夜节律的表达有调节作用。

大鼠松果体Clock基因和芳烷脘N-乙酰基转移酶基因的昼夜节律性表达及光照影响

探讨12h光照、12h黑暗交替(12h-light:12h-darkcycle,LD)及持续黑暗(constantdarkness,DD)光制下松果体Clock基因和芳烷脘N-乙酰基转移酶基因(arylalkylamineN-acetyltransferasegene,NAT)是否存在昼夜节律性表达及其光反应变化。Sprague-Dawley大鼠在LD和DD光制下分别被饲养4周(n=36)和8周(n=36)后,在一昼夜内每隔4h采集一组松果体组织(n=6),提取总RNA,用竞争性定量RT-PCR测定不同昼夜时点样品中Clock及NAT基因的mRNA相对表达量,通过余弦法和ClockLab软件获取节律参数,并经振幅检验是否存在昼夜节律。结果如下:(1)在DD或LD光制下,松果体Clock和NAT基因mRNA的表达均呈现夜高昼低的节律性振荡(P<0.05)。(2)与DD光制下比较,LD光制下松果体Clock和NAT基因的表达振幅及峰值相的mRNA水平均降低(P<0.05)。(3)在DD或LD光制下,Clock和NAT基因之间显示相似的节律性表达(P>0.05)。结果表明,Clock和NAT基因在松果体中存在同步的内源性昼夜节律表达,光照作用可使其表达下调。

光照对中枢和外周组织生物钟Clock基因表达的影响

[目的]分析光照对中枢和外周组织生物钟Clock基因mRNA表达的影响。[方法]采用竞争性RT_PCR法测定不同光照条件下中枢和外周组织中Clock基因的昼夜表达规律。[结果]发现Clock基因mRNA不仅在中枢 (下丘脑视交叉上核 ,SCN) ,而且在外周 (淋巴细胞 )均具有昼夜节律性表达。在光照 -黑暗交替光制下 ,中枢和外周Clock基因的表达几乎呈反相关系 ;在全黑暗条件下 ,Clock基因mRNA的表达存在昼夜节律 ,中枢和外周的Clock基因mRMA表达的峰值相位存在约8h的相位差。[结论]Clock基因的昼夜节律表达具内源性特征 ;

下调受精卵中Clock基因对早期小鼠胚胎DNA甲基化的影响

目的通过干扰小鼠二细胞受精卵中节律基因Clock的表达，研究Clock对小鼠早期胚胎DNA甲基化的影响。方法将Clock基因的RNAi干扰质粒转染到通过人工授精得到的二细胞受精卵中，通过移植假孕雌鼠获得7．5～11．5dpc的小鼠胚胎，并检测其基因组DNA甲基化水平和甲基转移酶Dnmt3a和Dnmt3b的表达。结果Clock干扰组无论是基因组DNA甲基化水平还是甲基转移酶Dnmt3a、Dnmt3b的表达量均较对照组高（均P〈0．01）。结论降低小鼠受精卵中节律基因Clock的表达量，可以通过影响甲基转移酶Dnmt3a和Dnmt3b而改变其胚胎发育中DNA甲基化水平。

抑制MS-1细胞Clock基因表达引起DNA甲基化水平降低

目的探讨Clock基因对MS-1细胞甲基化水平的影响及Clock基因参与调控细胞增殖的机制。方法采用siRNA干扰MS-1细胞Clock基因表达,检测细胞DNA甲基化水平变化,以及甲基化结合蛋白MECP2,影响细胞生长和增殖的Wnt/β-Catenin信号通路β-Catenin基因的表达情况。结果与对照组相比,抑制Clock基因表达后,MS-1细胞甲基化水平显著降低,且Mecp2和β-Catenin基因的表达均明显减少。抑制Clock基因组(CK)和阴性对照组(NC)甲基化DNA占总DNA比率分别为:(1.067±0.034)%和(1.983±0.154)%。Real-time PCR结果表明,CK组β-Catenin基因相对表达量为1.00000±0.09547,NC组为1.62584±0.17167;CK组Mecp2为0.98824±0.12243,NC组为1.80979±0.18520。Western blot结果显示,CK组β-CATENIN/β-TUBLLIN的相对IOD值为1.093368±0.214433,NC组为3.305374±0.260016;CK组MECP2/β-TUBLLIN的相对IOD值为0.289546±0.104738,NC组为0.649544±0.140909。结论 Clock基因能够影响细胞甲基化水平,并且可能通过调控甲基化结合蛋白MECP2表达和Wnt/β-Catenin信号通路影响细胞增殖。

CLOCK基因多态性与广西地区男性不育的相关性研究

目的探讨生物钟基因CLOCK基因多态性与广西地区男性不育的相关性。方法选取2019年3月至10月广西医科大学第一附属医院生殖中心和男性科门诊就诊的149例不育男性患者纳入不育组,根据精液检查分为少弱精不育组和原发性不育组;另选取91例同期体检有自然生育史、近期精液常规检查均为正常的健康男性作为对照组。采用DNA测序技术对CLOCK基因rs3749474和rs4580704位点进行基因分型。采用Logistic回归分析校正年龄后计算OR和95%CI,对CLOCK基因多态性和男性不育的遗传易感性进行关联分析。应用SHEsis软件进行单倍型分析。结果不育组和对照组rs3749474 CC基因型和C等位基因频率分布差异具有统计学意义(P=0.011,OR=2.78,95%CI:1.26~6.11;P=0.008,OR=1.68,95%CI:1.15~2.45)。而rs4580704位点各基因型和等位基因在对照组和不育组中的频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。亚组分析结果显示,rs3749474和rs4580704位点的基因型和等位基因在对照组和少弱精不育组中的频率分布差异均无统计学意义(P>0.05)。而与对照组比较,rs3749474 CC基因型和C等位基因均显著增加男性原发性不育的风险(OR分别为4.81和2.22);rs4580704 CG、GG基因型和G等位基因携带者男性不育的患病风险增加(OR分别为3.78、4.02和2.13)。单倍型分析发现,CG和TC单倍型的频率在原发性不育组和对照组中的分布差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CLOCK基因rs3749474和rs4580704多态性与广西地区男性原发性不育有相关性。

clock基因干扰质粒的构建及干扰效率测定

目的:构建clock基因的干扰质粒,为深入研究clock基因在信号转导通路中的作用提供有效手段。方法:采用M-folder生物软件选择2个clock基因干扰位点,并根据3个干扰片段及一个阴性对照片段,定向克隆到pGenesil-1干扰载体并测序验证。将干扰质粒及对照质粒分别转染至NIH3T3细胞,并通过检测RT-PCR产物量以获得干扰效率。结果:RT-PCR产物检测结果显示干扰质粒pGenesil-1/clock-Ⅱ干扰效率最高,其clock表达量降低了74%,而pGenesil-1/clock-Ⅰ干扰组clock表达量只降低了2%。结论:成功构建了对clock基因具有显著干扰效率的pGenesil-1/clock-Ⅱ干扰质粒,为进一步研究clock基因的功能奠定了基础。

CLOCK基因在胃癌中表达的临床分析

研究CLOCK基因在人体组织内的表达以及相关肿瘤的分析,探讨基因表达的临床意义。方法:通过挖掘TCGA和GEO数据库,分析CLOCK基因在人组织中的表达,分析基因与肿瘤患者的预后关系、基因对免疫细胞的影响、胃癌中的基因突变情况以及基因表达与胃癌分期的关系。结果:CLOCK基因在多种肿瘤组织中表达升高,也有表达低于正常组织的情况,基因表达与胃癌患者的预后相关性不大,但 是影响了胃癌患者免疫细胞的表达,胃癌中CLOCK基因的突变多为野生型,且基因表达与胃癌分期显著相关。结论:CLOCK在不同的肿瘤中都有表达,在胃癌中的表达以及突变情况可以影响患者的疾病进程。

CLOCK基因在甲状腺乳头状癌组织中的表达及临床意义

目的探讨生物钟基因CLOCK在甲状腺乳头状癌组织中的表达,并分析其与甲状腺癌的关系,为甲状腺癌的早期诊断提供科学依据。方法采用免疫组化方法检测CLOCK基因在74例甲状腺乳头状癌及癌旁组织中的表达水平,并分析其表达与临床病理特征的关系。结果在甲状腺乳头状癌组织与其配对的癌旁正常组织中,CLOCK基因阳性表达分别为68.9%(51/74)和40.5%(30/74)。两类组织中阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。CLOCK基因表达与甲状腺乳头状癌淋巴结转移及TNM分期有关(P<0.05)。结论 CLOCK基因可能与甲状腺乳头状癌的发生有重要关系,但其与肿瘤的侵袭和转移的关系需更深入的研究。

藏酋猴类似人clock基因片段的克隆

目的:在藏酋猴中,寻找和克隆与人clock基因类似的基因。方法:提取藏酋猴外周血白细胞RNA,逆转录为全基因组cDNA,利用人clock基因保守序列设计相关引物,克隆,测序,进行生物信息学分析。结果:扩增得到1994bp的核酸序列。该序列与人,苏门答腊猩猩,绵羊,小鼠,褐家鼠,原鸡和蟾蜍clock基因核酸序列同源性分别为99%,98%,94%,90%,90%,82%和75%。结论:藏酋猴基因组中存在与人clock基因相似的基因,该基因可能为藏酋猴clock基因。

Clock基因对雄性小鼠生殖功能影响

目的:通过干扰小鼠睾丸精子节律基因Clock的表达,研究Clock对雄性小鼠生殖能力的影响。方法:通过RNAi技术,向小鼠睾丸注射Clock干扰质粒干扰雄性小鼠睾丸节律基因Clock的表达。研究干扰Clock基因后精子数量、精子活力、体外受精率和雌鼠胎仔数变化,以及对精子顶体内透明质酸酶活性、芳香基硫酸酯酶A的含量影响。结果:Clock干扰质粒在体内可影响雄性小鼠的胎仔数,但注射干扰质粒后小鼠精子计数、精子活力及体外授精率无明显变化,精子顶体内透明质酸酶活性和芳香基硫酸酯酶A含量也无明显变化。结论:节律基因Clock与雄性小鼠生殖能力有密切关系。

干扰雄性小鼠睾丸Clock基因对胎鼠发育的影响及机制研究

【目的】研究干扰雄性小鼠睾丸Clock基因后,对小鼠胚胎着床及后期胎鼠发育的影响,并从甲基化的角度探讨引起胎鼠发育异常的原因。【方法】将成年雄性小鼠分为干扰组和对照组,分别于睾丸中注射干扰质粒和阴性质粒,与经过促排处理的雌鼠合笼,研究比较两组胚胎着床情况,观察两组胎鼠的外形及体重等指标的差异;观察胎鼠组织结构,比较两组是否存在差异;分析胎鼠总甲基化水平,同时测定甲基转移酶(DNMTs)水平,比较两组是否存在差异。【结果】:①与对照组比较,干扰组胚胎着床数下降(14.5 vs.20.33),胎儿体重减轻,死胎和异常胎数增多(P<0.05)。②干扰组胎鼠的心脏和脊柱发育分节出现异常。③11.5~16.5 dpc阶段胎鼠总甲基化水平,干扰组较对照组显著降低(8.59 vs.18.25);干扰组甲基转移酶DNMT3B-4的相对IOD值低于对照组(0.124 vs.0.141),有统计学意义。【结论】干扰雄性小鼠睾丸Clock基因,可导致胚胎着床数下降,胎鼠发育异常增多,体重减轻。甲基转移酶DNMT3B-4水平下调及总甲基化水平下降,可能是影响胎鼠发育异常的原因。本研究表明Clock基因与胎鼠发育密切相关,初步探讨引起不育的机制,为揭示该类疾病发病机制提供依据。

睾丸Clock基因下调后小鼠精子前向运动百分率降低的机制

目的通过对睾丸精子超微结构的观察和实验室前期数据的生物信息学再分析,探讨睾丸Clock基因下调使小鼠精子前向运动百分率降低的机制。方法选取SPF级ICR雄性小鼠(8周龄)14只,随机分为实验组和对照组,每组6只,另2只小鼠作为免疫共沉淀实验样本。获取小鼠Clock基因下调的睾丸组织,透射电镜观察其中精子的超微结构。结合对实验室前期数据再分析的结果,ELISA检测睾丸组织中α-KGDH的活性,并以RT-qPCR检测睾丸中二氢硫辛酸脱氢酶(DLD)的转录组水平。最后在野生型小鼠睾丸组织中验证CLOCK蛋白与DLD蛋白的相互作用关系。结果与对照组相比,实验组Clock基因的表达显著降低(P<0.001);实验组睾丸中精子细胞线粒体形态和排列出现异常;差异蛋白的GO和KEGG富集分析提示,实验组精子线粒体中三羧酸循环限速酶α-KGDH的亚基构成蛋白之一的DLD明显下调(P<0.05);与对照组相比,实验组睾丸α-酮戊二酸脱氢酶复合体(α-KGDH)酶活性明显降低(P<0.05);与对照组相比,实验组睾丸Dld基因mRNA水平也明显下调(P<0.05);而野生型小鼠睾丸中CLOCK蛋白与DLD蛋白能够相互作用。结论睾丸Clock基因的下调可导致小鼠精子线粒体结构和功能蛋白发生改变,从而限制了线粒体能量的产出,最终导致精子前向运动百分率降低。

干扰睾丸Clock基因对小鼠体外受精的影响

目的:研究雄鼠睾丸Clock基因沉默后,小鼠体外受精的变化及机制。方法:通过在ICR小鼠睾丸内注射Clock干扰质粒(实验组)和HK阴性对照质粒(对照组),注射18天后收集雄鼠精子,计数精子浓度,前向运动精子百分率和精子总活率。再将孵育好的精子加入卵培养皿中,分别观察卵丘颗粒细胞驱散情况及卵裂情况,计算受精率、囊胚生成百分率和胚胎孵化率。结果:睾丸Clock基因沉默后,小鼠精子活动率及前向运动率较对照组降低(p<0.05),实验组精子驱散卵丘颗粒细胞能力的时间延长(p<0.001)。结论:睾丸clock基因可影响精子驱散卵丘颗粒细胞的能力,该机制在Clock基因影响小鼠生殖的过程中的作用有待进一步研究。

CLOCK基因多态性与脑卒中后静脉血栓形成的关系

目的 探讨昼夜运动时钟基因(CLOCK)基因多态性与脑卒中后静脉血栓形成的关系。方法 收集344例脑卒中患者为脑卒中组,根据是否伴有静脉血栓分为未伴静脉血栓组和伴静脑血栓组,根据斑块稳定性又分为稳定斑块组和不稳定斑块组。另选取同期健康志愿者169例为正常组。结果 正常组CLOCK rs4580704 GG基因型高于脑卒中组,CG基因型低于脑卒中组,差异均有统计学意义(P<0.05)。脑卒中患者CLOCK rs4580704 CC组生存率显著高于CG组,但显著低于CG+GG组和GG组(均P<0.05)。与未伴有静脉血栓组比较,伴有静脉血栓组CLOCK rs4580704 CC及CG比例显著升高,CG+GG及GG比例显著下降(均P<0.05)。脑卒中伴有静脉血栓患者CLOCK rs4580704 CC组生存率显著高于CG组,但显著低于CG+GG组和GG组(均P<0.05)。与稳定斑块组比较,不稳定斑块组CLOCK rs4580704 CC比例显著下降,CG和CG+GG比例显著上升(均P<0.05)。结论 CLOCK rs4580704基因多态性参与脑卒中后静脉血栓形成,CLOCK rs4580704 CG+GG减少脑卒中后静脉血栓形成,提示可能作为临床治疗脑卒中相关神经疾病重要指标。

CLOCK基因多态性与心理障碍的相关性研究

目的探讨昼夜节律CLOCK基因多态性与心理障碍的关系。方法以新疆克拉玛依市石油管理局油田作业工人为研究对象,采用SCL-90问卷进行心理状况调查,按照性别、年龄1∶1匹配,最终确定心理障碍阳性组和心理障碍阴性组各176名,应用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性,检测CLOCK基因rs1801260和rs6850524位点多态性。结果 CLOCK基因rs1801260位点、rs6850524位点在心障碍阳性组和心理障碍阴性组中分布差异均有统计学意义(P<0.05),CLOCK基因rs6850524位点以GG基因型为参照,携带GC基因型是发生心理障碍的危险因素(OR=5.554,95%CI=2.137~14.435)。结论 CLOCK基因rs6850524位点GC基因型可能为心理障碍发生的危险因素之一。