抗华支睾吸虫代谢抗原单克隆抗体的制备及鉴定研究

目的建立分泌抗华支睾吸虫代谢抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株。方法用华支睾吸虫成虫代谢抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株,测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价,检测单抗与日本血吸虫全虫可溶性抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应。结果获得3株分泌高滴度抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应,3株单抗均属IgG。结论制备的抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗,为制备免疫诊断试剂盒奠定了基础。

抗华支睾吸虫单克隆抗体的制备和鉴定

目的：建立分泌抗华支睾吸虫成虫的单克隆抗体杂交瘤细胞株并进行鉴定。方法：用华支睾吸虫成虫可溶性抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价，检测单抗与日本血吸虫虫卵抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应，用ＩＦＡＴ进行单抗识别的抗原定位。结果：获得５株分泌高滴度抗华支睾吸虫成虫单抗的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应；５株单抗均属ＩｇＭ；单抗所识别的抗原定位于华支睾吸虫肠管壁。结论：制备的抗华支睾吸虫成虫的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗。

新颖抗猪流行性腹泻免疫制剂

以新生乳猪增殖猪流行性腹泻病毒（PEDV），通过蔗糖密度梯度离心纯化，获得结构较为完整的病毒颗粒，病毒ELISA效价为1：3×105，蛋白含量为3．96mg／mL．将提纯的PEDV免疫Balb／C小鼠，取其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合．融合率为95．6％。用间接ELISA筛选并进行3次再克隆，阳性率达100％，共获用15株能稳定分泌特异性抗PEDV单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞．其染色体数平均为90～100．所分泌抗体具有高度特异性，腹水ELISA效价为1：103～1：106。用混合单抗对新生猪的保护试验证明，这些单抗不论在体内或体外．对PEDV均有中和作用．试验绪可以得到抗体的保护耐过不死，而病毒对照组的猪只全部死亡。将混合单抗用于PED的发病场，保护率达91％．建立了PPA－ELISA、McAb阻断ELISA及MCAb免疫荧光试验等快速诊断方法．

抗绵羊进行性肺炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用提纯的OPPV细胞抗原免疫BALB/c小鼠脾脏与SP2/0小鼠骨髓细胞融合,融合率为70%,以ELISA双抗体夹心法进行检测,阳性率为20%,经过有限稀释法克隆出1A_6、2B_8、1G_3、2G_44株分泌抗OPPV抗原的单克隆体杂交瘤细胞株。选择抗体分泌滴度高的1A_6细胞进行了较详细的研究,结果表明,其核内染色体数为96～110条,抗体属性为IgG1,轻链为K链,IFA试验表明产生的McAb对OPPV有特异性,细胞传30代并在液氮中保存半年后复苏仍能稳定地分泌抗OPPV McAb,细胞分泌抗体的ELISA滴度腹水为6.4×10~4,上清为640,McAb经硫基乙醇还原后在SDS-PAG上呈现2条区带,一条为重链部分,MW50000,另一条为轻链部分,MW为25000。

抗KDR-Fc杂交瘤细胞系的建立

用杂交瘤技术建立抗KDRFc的杂交瘤细胞系,以KDRFc抗原免疫雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经ELISA间接法检测和有限稀释法克隆培养,再经稳定性检测、效价检测,筛选出分泌抗KDRFc单克隆抗体的杂交瘤细胞.得到了10株能持续分泌抗KDRFc的单克隆抗体的细胞株,其中3株分泌的单抗具有较高的生物活性、特异性和稳定性.

10株分泌HSV-Ⅱ型单克隆抗体的杂交瘤细胞系的建立

用HSV-ⅡUW268株免疫BALB/c鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选、克隆化后获得10株分泌抗HSV-ⅡUW268株单克隆抗体的细胞系。其中1株仅与HSV-ⅡUW268株发生特异免疫反应,9株与HSV-Ⅱ和HSV-IF_(17)均发生免疫反应。用免疫沉淀试验检测单克隆抗体的Ig类型为IgG_1。保存的杂交瘤细胞仍能稳定地分泌抗HSV-ⅡUW268株的单克隆抗体。

分泌抗—HBe单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用ＨＢｅＡｇ阳性血清纯化ＨＢｅＡｇ，免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，反复克隆化培养，最终获得４株分泌抗－ＨＢｅ单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对其中两株进行了鉴定。其细胞培养上清中的ＥＬ／ＩＳＡ效价分别为１：８００和１：５００，诱生同属小鼠腹水中的ＥＬＩＳＡ效价均为１：１０００，特异性试验表明，两株杂交瘤分泌的抗体为特异性抗体，小鼠Ｉｇ亚类鉴定，两株抗体均为ＩｇＧ１亚类球蛋白。细胞染色体数为９５～１１０条。结果证明，此细胞株为特异性分泌抗—Ｈｋｅ单克隆抗体细胞株。

抗基孔肯雅病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系及应用研究

用BALB/C小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与经基孔肯雅(CHIK)病毒免疫后的BALB/C小鼠的B淋巴细胞进行融合,共获得11株能分泌抗CHIK病毒McAb杂交瘤细胞系。融合率为80.6％,阳性率为29.7％。经微量中和试验证明,11株McAb均具有抗CHIK原型及从棕果蝠与人体分离到的地方株CHIK病毒的中和抗体。血凝抑制试验(HI)及间接免疫荧光试验(IF)均为阳性,McAb培养上清效价前者为1:32～1:64,后者为1:40～1:80,McAb腹水效价前者1:2560～1:5120,后者1:2560～1:10240。11株McAb均为IgG2b亚类,具有明显的病毒特异性。

人促甲状腺激素单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备特异性强、灵敏度高的人促甲状腺激素(hTSH)单克隆抗体,为建立高灵敏性和高特异性的hTSH检测方法奠定基础。方法:人工合成人促甲状腺激素(hTSH)上的28个氨基酸,采用戊二醛交联法与牛血清白蛋白(BSA)构建完全抗原。用人工免疫原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术建立分泌抗hTSH单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对得到的单抗进行鉴定。结果:建立了一株杂交瘤细胞4E5,制备了腹水单抗,经鉴定,抗体重链属于IgG1类型,轻链属于κ型,McAb腹水ELISA效价达1:1.6×105,与促黄体生成激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)无明显交叉反应,细胞株冻存复苏后抗体分泌稳定。结论:本实验建立的细胞株显示稳定性好,特异性高,McAb腹水效价高,为进一步提高hTSH检测的灵敏性和简便性提供依据。

EpCAM蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备

目的:原核表达EpCAM蛋白并制备抗EpCAM特异性单克隆抗体,初步鉴定相应单克隆抗体的特性。方法:PCR扩增EpCAM基因胞外区,将目的基因亚克隆至载体pET-28a(+),转化至大肠埃希菌株BL21,IPTG诱导表达,组氨酸亲和层析法纯化表达产物。纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,将成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合,经ELISA筛选得到分泌特异性抗EpCAM的单克隆抗体的细胞株,免疫BALB/c小鼠进一步制备相应的单克隆抗体,并通过Western blot(蛋白质印记)和FACS(流式细胞分析)鉴定单抗的特异性及生物学活性。结果:成功构建重组表达载体pET28a-EpCAM并在大肠杆菌中获得表达,经His-tag亲和层析法获得纯化的EpCAM重组蛋白。EpCAM重组蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合、筛选,获得两株稳定分泌EpCAM抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4B2、2F2并免疫BALB/c小鼠获得相应的单克隆抗体。Western blot结果显示4B2腹水纯化所得单抗能够识别FaDu细胞系(人咽鳞癌细胞)中的EpCAM蛋白,但2F2未能识别FaDu细胞中的变性的EpCAM蛋白。FACS结果显示两者均能和FaDu细胞中天然的EpCAM蛋白结合。讨论:成功制备了抗EpCAM的单克隆抗体,并能够识别人咽鳞癌细胞系FaDu中表达的EpCAM,为进一步研究EpCAM抗体在肿瘤治疗中的作用提供基础。

抗萘单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

为了构建针对石油运输泄露导致的海洋环境中萘等多环芳烃污染的免疫学快速检测方法,需获得高效稳定的分泌抗萘单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本文以2-萘丁酸-KLH为免疫抗原免疫BALb/c小鼠,间接竞争ELISA测定小鼠血清效价,用细胞融合筛选技术筛选抗萘单克隆抗体杂交瘤细胞株,捕获ELISA测定小鼠免疫球蛋白亚型。结果显示,实验小鼠免疫血清效价最高能达到1∶80000,经过HAT筛选、复检和亚克隆后得到5个能分泌抗萘单克隆抗体的细胞株,细胞株上清液效价最高能达到1∶15625,抗萘单克隆抗体免疫球蛋白亚型均为IgG1,Kappa轻链。本方法成功构建的杂交瘤细胞株能稳定高效分泌抗萘单克隆抗体,抗体亚型符合免疫学检测的特性,为萘的ELISA检测方法建立及胶体金免疫层析(GICA)试纸条的研制提供了稳定高效的单克隆抗体源。

抗DEP单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

为构建针对水环境中邻苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate,DEP)等邻苯二甲酸酯类(Phthalates,PAEs)化合物的免疫学快速检测方法,需获得高效稳定的分泌抗DEP单克隆抗体的杂交瘤细胞株.以邻苯二甲酸单乙酯(Monoethylphthalate,MEP)-BSA为免疫抗原免疫BALb/c小鼠,间接竞争ELISA测定小鼠血清效价,用细胞融合筛选技术筛选抗DEP单克隆抗体杂交瘤细胞株.结果显示,实验小鼠免疫血清效价最高能达到1:5 000,经过HAT筛选、复检和亚克隆后得到9个能分泌抗DEP单克隆抗体的细胞株,细胞株上清液效价最高能达到1:10 000,对DEP的抑制率最高能达到86.5%,且其对11种结构类似物的交叉反应率均低于0.1%,特异性较好.本研究成功构建的杂交瘤细胞株能稳定高效分泌抗DEP单克隆抗体,可为DEP的ELISA检测方法建立及胶体金免疫层析(Colloidal gold immunochromatography assay,GICA)试纸条的研制提供稳定高效的单克隆抗体源.