气肿疽梭菌C54-1株的制备与检定

为研究气肿疽梭菌C54-1株(CVCC60001)的菌种特性,制备了1批气肿疽梭菌C54-1株,并对菌种的形态及生化特性、培养特性、血清学特性、真空度、纯粹、剩余水分、毒力及免疫原性、16S rDNA等进行检定,以及对于该菌的适宜培养基促生长能力等方面进行了比较。实验结果表明,该冻干菌种的形态及生化特性、培养特性、血清学特性、真空度、纯粹、剩余水分、毒力及免疫原性均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》二〇〇〇版质量标准的规定。16S rDNA鉴定为气肿疽梭菌,相似度为99.93%。在免疫原性检定中,使用致死剂量攻毒时,免疫组能够4/4被保护,证明该菌明矾苗免疫效果良好。使用商品化梭菌培养基对于该菌培养进行了比对,证实商品化培养基替代厌气肉肝汤的可能性。本研究为气肿疽梭菌的制备和检定提供参考依据,并使用不同培养基进行比对研究,为该菌的稳定培养和疫苗工艺改进提供了研究基础。

延边黄牛气肿疽间接ELISA诊断方法的建立

[目的]检测延边黄牛气肿疽病原体,为牛气肿疽的检测提供科学方法和依据。[方法]采用气肿疽梭菌裂解菌体为抗原,建立检测该病原菌的酶联免疫吸附检测方法,确定其最适工作条件。[结果]气肿疽梭菌菌体裂解抗原最适包被浓度为50μg/m l;待检血清的最适稀释度为1∶200,酶标二抗的最适工作浓度为1∶2 000;对随机采集于延边地区的30份牛血清样品进行间接ELISA检测,阳性率为20%。[结论]建立的间接ELISA方法特异性和重复性好。

吉林延边地区牛气肿疽病的诊断报告

本研究旨在对吉林省延吉市三道湾镇两位农户饲养的病死黄牛进行快速诊断。本试验采集肝脏、脾脏、心脏、肌肉等组织,通过流行病学调查、临床剖检、显微镜观察、细菌培养观察、生化试验、分子生物学试验及动物试验进行气肿疽病诊断。病死黄牛的肌肉部位触压有捻发音,切面有大量血液和气泡流出,镜检可见两端钝圆、有芽孢的大杆菌,在肝片肉汤培养基中形成上清清朗、底部有松散的白色沉淀,生化试验均呈现气肿疽厌气菌所特有的产酸产气反应,PCR扩增出大小为501bp的特异性条带。结果表明延边地区两病死黄牛感染了气肿疽病,证明了该地区气肿疽梭菌的存在。本试验首次分离鉴定出气肿疽梭菌延边株,为该地区气肿疽病的诊断和防制提供了重要的参考依据,同时为进一步研究该病的药物防制和免疫防制奠定了重要基础。

气肿疽梭菌菌体抗原分析

[目的]了解气肿疽梭菌的抗原特性。[方法]对气肿疽梭菌标准菌株(C54-1)的菌体抗原进行提纯过柱,通过制备小鼠免疫血清及免疫印迹技术进行了反应原性试验。[结果]气肿疽梭菌的菌体抗原有8条蛋白带,电泳图谱上分别出现了与之相对应的条带,分子质量分别为93、72、56、46、38、26、15、11 kD,其中第2(72 kD)、5(38 kD)、6(26 kD)峰的抗原表现出明显的特异性。用酶联免疫印迹技术分析气肿疽梭菌分泌蛋白的抗原组分,气肿疽梭菌感染小鼠的血清能与抗原组分蛋白发生反应,其中72、38、26 kD蛋白带显色最深。[结论]为气肿疽梭菌的深入研究提供了理论依据。

气肿疽梭菌检测方法概述

气肿疽(Clostridium chauvoei infection)病原体为气肿疽梭菌,是一种发生于反刍动物的急性、热性、败血性传染病。常见的典型症状为发病动物肌肉丰满部位发生炎性、气性肿胀,触压有捻发音,该病的流行有一定的地方性、季节性,多发生在潮湿的山谷、牧场,且在天气炎热的多雨季节。近几年常有暴发牛气肿疽的报道,给养殖业的发展带来了巨大的冲击和经济损失,同时也逐渐地威胁到畜牧生产和人类的安全。国内关于该病的研究多数为病例报道,对于该病的详细研究和综述却是少之又少,论文参考国内外相关文献,从方法、原理、优缺点等多个方面阐述气肿疽的检测方法,以期为该病的诊断提供参考。

气肿疽梭菌鞭毛基因克隆载体的构建

根据GenBank中发表的气肿疽鞭毛蛋白的结构基因FliA(C)的序列,从中截取抗原表位部分基因序列,设计合成1对引物,引物的5`和3`端分别加入了BamHⅠ和XhoⅠ2个酶切位点。通过降落PCR法扩增合成长度为429bp的目的基因片段。将PCR产物克隆于pMD18-T simple载体,之后将其转入大肠杆菌DH 5α感受态细胞筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD18-T-FliA(C)并进行PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定。结果表明:扩增的目的基因与GenBank登录的ATCC10092菌株序列同源性为99%,4个碱基不同,仅有1个氨基酸不同。测出的基因序列发表于GenBank,登录号为KF712490。试验证明用降落PCR方法能方便、快速、准确的获得目的基因片段。本试验成功构建了重组克隆载体pMD18-T-FliA(C),为气肿疽鞭毛蛋白的表达载体构建及鞭毛蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。

家畜气肿疽的研究进展

气肿疽是由气肿疽梭菌感染牛、羊和其它动物所引起的急性、败血性传染病,以肌肉丰满部位发生炎性肿胀、坏死为特征。世界上所有养牛的国家均有本病的发生并具有较高的死亡率,对全球的养殖业尤其是养牛业造成一定的经济损失。该病在我国各地均有发生,影响我国养牛业的健康发展。本文对该病的病原学、流行病学、临床症状、发病机理、病理变化、诊断方法、防治措施等几个方面进行了综述,以期为该病的有效防控提供有益的参考。

气肿疽梭菌HLJ-1株分离鉴定及系统进化分析

2015年6月,内蒙古某牛场爆发疑似气肿疽疫病,为了有效防控该病,无菌采集炎性气肿的肌肉进行需氧和厌氧菌的分离鉴定和药敏试验,结果在厌氧条件下从患病牛肌肉内分离出无荚膜,革兰氏染色呈阳性两端钝圆的杆菌。经表型特征和生化鉴定表明分离菌株与气肿疽梭菌相符,进一步对16S rDNA通用引物扩增得到的基因测序结果分析表明,其与气肿疽梭菌株同源性最高达95.8%,毒素检测表明含有α毒素。以上结果证明该菌株为气肿疽梭菌。分离菌株对蒽诺沙星、环丙沙星等药物高度敏感。为该病的防制提供了理论依据和物质基础。

气肿疽梭菌NanA基因核酸疫苗的免疫效果评价

为了检测气肿疽梭菌NanA基因核酸疫苗的免疫效果,在成功构建pVAX1-NanA真核表达重组质粒的基础上将其转染至Vero细胞,通过间接免疫荧光鉴定其表达,并将成功构建的pVAX1-NanA质粒大量提取后免疫Balb/c小鼠,设置pVAX1-NanA核酸疫苗组、pVAX1空载体组和PBS对照组。对小鼠采血并分离血清,用ELISA测定血清中的IgG、IgG1、IgG2a抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平;第3次免疫2周后,用流式细胞仪测定小鼠脾脏中的CD4^+和CD8^+T细胞水平。结果表明,pVAX1-NanA核酸疫苗免疫Balb/c小鼠后,小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a的抗体水平极显著高于pVAX1空载体组和PBS对照组(P<0.01);IFN-γ和IL-4细胞因子水平极显著高于pVAX1空载体组和PBS对照组(P<0.01);CD4^+、CD8^+T细胞分析表明,pVAX1-NanA免疫组的CD4^+和CD8^+T细胞水平显著高于pVAX1组和PBS对照组(P<0.05),pVAX1-NanA核酸疫苗组的CD4^+/CD8^+T细胞比值高于pVAX1空载体组与PBS对照组(P<0.05),pVAX1空载体组和PBS对照组之间无显著差异(P>0.05)。试验成功制备了pVAX1-NanA核酸疫苗,且pVAX1-NanA核酸疫苗可刺激Balb/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫。

气肿疽梭菌CctA基因的真核表达

为了控制延边地区气肿疽病的发病率,制备出有效的核酸疫苗,根据NCBI上气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)的基因序列设计出一对特异性引物。将PCR扩增的CctA基因克隆到pMD19-Tsimple载体,对测序正确的基因进行序列分析,再次克隆至pcDNA3.1-1真核表达载体,并且将其转染Vero细胞。结果表明,pcDNA3.1-CctA组通过转染后的细胞存在绿色荧光的现象,同时pcDNA3.1-CctA重组质粒表达的产物大小约19ku,说明Vero细胞中的pcDNA3.1-CctA质粒成功表达了CctA蛋白。

延边株气肿疽梭菌鞭毛蛋白FliA基因克隆及生物信息学分析

根据气肿疽鞭毛基因(GenBank登录号:AB058932)的参考序列,PCR扩增并克隆延边株气肿疽梭菌鞭毛蛋白FliA基因。成功克隆后测序,并采用生物信息学方法对鞭毛蛋白FliA基因的蛋白质二级结构、结构功能域、三级结构及抗原表位等重要参数进行了预测和分析。结果表明:与AB058932序列相比,存在38处突变,核苷酸序列的同源性和氨基酸序列的同源性均为97%;FliA蛋白的理论等电点为6.99,不存在跨膜区和信号肽序列,二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,主要有15个潜在B细胞抗原表位区,17个限制性CTL抗原表位区。本试验为延边株气肿疽FliA蛋白功能的深入研究奠定了基础。

利用SOE-PCR与TD-PCR技术对气肿疽梭菌FliA(C)-NanA融合基因扩增方法的构建

[目的]构建联合表达气肿疽梭菌的鞭毛蛋白与分泌蛋白神经氨酸酶的方法,用以制备气肿疽生物工程亚单位疫苗。[方法]根据已公布的气肿疽梭菌FliA(C)和NanA序列设计引物,联合使用SOE-PCR与TD-PCR技术,建立融合基因FliA(C)-NanA的扩增方法。[结果]试验成功扩增出了融合基因FliA(C)-NanA。[结论]SOE-PCR方法无需在引物设计中加入酶切位点进行连接,降低了试验成本,且2个基因间未加入其他核酸序列,避免了表达出影响免疫效果的蛋白;TD-PCR的应用节省了试验时间,避免了筛选退火温度的繁琐步骤,解决了基因丢失的问题。

气肿疽延边株FliA基因真核表达载体的构建

为构建气肿疽延边株FliA基因的真核表达载体PVAX1-FliA,根据Genbank气肿疽鞭毛基因(登录号:AB058932)的参考序列,利用Primer 5.0设计1对引物,通过PCR扩增出完整的气肿疽延边株FliA基因。将目的基因与pMD-19T载体连接转化到大肠杆菌DH5α,进行测序、PCR、双酶切鉴定阳性克隆质粒。用回收后的基因与真核表达载体PVAX-1连接,并经双酶切、测序鉴定。本试验成功构建了鞭毛基因的重组真核表达载体PVAX1-FliA,为探讨气肿疽延边株FliA基因的分子生物学特性和功能及免疫新途径提供依据。

气肿疽NanA基因真核表达质粒的构建与鉴定

为构建气肿疽NanA基因真核表达质粒,根据GenBank中已发表的气肿疽梭菌NanA基因序列,设计合成了1对特异性引物,以气肿疽梭菌基因组DNA为模板,扩增出NanA目的基因并克隆至pMD 18-T simple载体,将连接后的pMD 18-T-NanA进行鉴定分析。将克隆质粒pMD 18-T-NanA进行双酶切后,与pVAX1真核表达质粒连接。结果表明:构建的重组克隆质粒pMD 18-T-NanA和重组表达质粒pVAX1-NanA经PCR鉴定和酶切鉴定正确。该试验成功构建了气肿疽NanA基因真核表达质粒,为气肿疽核酸疫苗的制备奠定了基础。

气肿疽梭菌套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中的气肿疽梭菌16SrRNA基因序列(登录号EU106373),设计合成了2对特异性引物,建立了适合气肿疽梭菌快速检测的套式PCR方法。对该方法的最佳反应条件进行了筛选,并采用该方法对气肿疽梭菌进行了检测。结果显示,气肿疽梭菌能扩增到341bp的条带,而魏氏梭菌、巴氏杆菌和腐败梭菌的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是56.41pg,第2次扩增的敏感性是56.41fg,第2次比第1次扩增的敏感性高103倍。表明,建立的套式PCR方法具有较高的敏感性和特异性,可用于气肿疽梭菌的检测,为气肿疽的临床检测、流行病学调查和进出口检疫提供了新的技术手段。

延边地区牛气肿疽的流行病学调查

本研究旨在了解吉林省延边地区气肿疽的流行情况,分别采用血涂片染色镜检法和PCR方法对延边地区4个县市的165头份牛的血液样本进行了检测,并对不同地区、不同饲养方式、不同品种、不同年龄、不同地理条件等采集的样本进行了比较。结果显示,PCR方法检测牛气肿疽的平均阳性率为15.2%(25/165),显著高于血涂片染色镜检法检测的阳性率8.5%(14/165)。统计学分析表明,牛气肿疽感染率在不同地区、不同品种之间差异性不显著(P>0.05);而不同年龄、不同地理条件气肿疽感染率差异性显著(P<0.05);在个体农户饲养方式中的阳性率显著高于规模化养殖方式(P<0.01),说明牛感染气肿疽受年龄、地理条件、饲养方式等因素的影响较大。本试验表明吉林省延边地区是牛气肿疽的流行地区,为当地的牛气肿疽的防控提供了理论依据。

气肿疽梭菌细胞毒素CctA基因的克隆及生物信息学分析

根据GenBank中气肿疽梭菌细胞毒素CctA基因的参考序列,采用PCR方法扩增细胞毒素CctA基因。在将该基因进行克隆和测序后利用生物信息学方法,对细胞毒素CctA蛋白的理化性质、结构功能域、蛋白质二级结构和三级结构及抗原表位等重要参数进行了预测和分析。结果表明:与参考序列(JQ692583)相比,存在3处突变,核苷酸序列的同源性和氨基酸序列的同源性均为99.4%;CctA蛋白的理论等电点为8.00,不存在跨膜区和信号肽序列,二级结构以β-折叠和无规则卷曲为主,主要有4个抗原表位区域。本研究为CctA蛋白功能的深入研究提供了参考,并为气肿疽梭菌单克隆抗体的制备及合成肽疫苗的研发奠定了基础。