牦牛源腐败梭菌病的病原分离鉴定及生物学信息分析

为了研究青海果洛地区牦牛源腐败梭菌病的生物学特性,对青海省果洛州玛沁县兽医站送检的3份病死牦牛脏器样本进行细菌分离培养、鉴定及生物学特性分析,并对分离的病原菌株进行了PCR特异性扩增及系统发育树比对。结果表明,从病死牛脾脏中分离到的菌种为革兰氏阳性大杆菌,该菌在pH 8.0的VF厌气肝汤中生长良好,在PH8.0的羊血琼脂培养基上能长出光滑凸起、边缘圆润并伴有溶血现象的菌落;将分离菌纯培养物递倍稀释后经皮下注射0.2 mL昆明系小白鼠,小鼠在24 h内全部死亡;从生长曲线可看出0~2 h为迟缓期,>2~14 h为对数期,>14~24 h为平稳期,24 h之后开始衰退。经特异性扩增得到与预期结果相符的大小为1 300 bp的ɑ毒素条带,16SrRNA扩增得到1 450 bp的目的条带,进化发育树分析结果显示该分离菌为腐败梭菌。经实验室分离鉴定,并结合分子生物学实验结果,确诊为牦牛腐败梭菌病,此诊断结果为该地区疫病的防控提供了技术支撑。

腐败梭菌α毒素基因的克隆与序列分析

应用聚合酶链式反应 (PCR)技术 ,从腐败梭菌强毒株C5 5_1中 ,扩增出大小为 132 7bp的腐败梭菌α毒素全基因 (csa132 7基因 ) ,并将其克隆入 pMD18_T载体中。转化至受体菌DH5α后 ,经Amp/IPTG/X_Gal选择培养 ,提取质粒 ,PCR和EcoRⅠ /PstⅠ双酶切鉴定 ,筛选阳性重组克隆。核苷酸序列分析证实 ,csa132 7基因开放阅读框架由 132 0bp组成 ,编码 4 4 0个氨基酸残基。与GenBank中登录的国外Fukushima 5株、Kagoshima 1株、Mie株和 4 4株的α毒素全基因相比 ,核苷酸同源率分别为 10 0 %、99 4 7%、99 2 5 %和 97 6 7% ,推导氨基酸的同源率分别达 10 0 %、10 0 %、99 7%和 97 0 6 %。表明本实验所克隆的csa132

腐败梭菌类毒素抗原含量与免疫效果之间的关系试验

为了确定腐败梭菌类毒素抗原含量与免疫效果之间的关系,将不同剂量的类毒素分别接种家兔和绵羊,免疫17日后测定血清中和效价,并用1MLD的毒素进行攻毒。测毒结果表明,1个家兔MLD的毒素含量为小鼠MLD的30倍,1个绵羊MLD的毒素含量为小鼠MLD的600倍。血清中和试验和免疫攻毒保护结果表明,类毒素含量与免疫效果在一定的范围内呈正相关,在家兔和绵羊上能提供保护的最小免疫剂量分别为100个小鼠MLD和300个小鼠MLD的类毒素。本试验结果为腐败梭菌疫苗的研制提供了重要的参考数据。

重组腐败梭菌α毒素对兔的免疫效力分析

本研究旨在获得重组腐败梭菌α毒素,并评价其毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计,通过人工合成获得基因片段Gcsa。将Gcsa克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,从而获得重组蛋白rCSA。利用Western blot方法检测纯化的rCSA与腐败梭菌α毒素抗血清的反应性,并采用犬肾细胞系(MDCK)和小鼠来检测rCSA的毒力。以甲醛脱毒后的rCSA与Montanide ISA 201佐剂以1∶1的比例制备疫苗,免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。结果表明,rCSA为可溶性表达,比例可达50%,且能与腐败梭菌抗血清反应。MDCK细胞毒性试验显示,0.15ng·mL^(-1)的rCSA即可引起明显的细胞病变;小鼠安全性试验显示,rCSA对ICR小鼠的最小致死量是1.5×10~6 ng·kg^(-1);每毫升的一免抗血清可中和100~130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;每毫升的二免抗血清可中和360~480个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;1个家兔MLD的腐败梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了4/4的保护。以上结果表明,rCSA具有良好的免疫原性,可作为腐败梭菌病基因工程亚单位疫苗的候选抗原。

腐败梭菌α毒素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性研究

根据GenBank公布的腐败梭菌α毒素基因序列,设计了一对引物,并以腐败梭菌基因组为模板,经PCR特异性扩增出腐败梭菌菌株HeB01的α毒素基因。序列分析表明,该基因产物大小为1323bp,与GenBank报道的4个腐败梭菌参考菌株α毒素基因序列同源性高于99·5%。将扩增的α毒素基因定向克隆到原核表达载体pQE30中,得到重组质粒pQE30-α,将重组质粒转化大肠杆菌M15中,得到重组菌株M15(pQE30-α),经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见表达的48kD特异条带;Westernblot和ELISA检测实验表明:表达的α毒素与抗天然α毒素抗体发生特异性反应,说明α毒素蛋白具有较好的免疫原性。将表达的α毒素蛋白制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护能力,表明该重组菌株有望作为腐败梭菌基因工程类毒素疫苗的候选生产菌株。

山羊“猝死症”病原菌的分离鉴定

对 3只突然死亡山羊的脏器进行了细菌学检查 ,分离到一种革兰氏阳性大杆菌 ,单在或成双 ,多为短链 ,无荚膜 ,有运动力 ;进行厌氧培养 ,在普通培养基上菌落呈不规则网状 ,分枝从中央向四周延伸 ,边缘不齐 ;血液琼脂平板厌氧培养 48h ,形成边缘不整齐、微隆起、淡灰色、周围有β溶血环的菌落 ;经生化鉴定为腐败梭菌。该菌可致死小白鼠 ,对环丙沙星、阿米卡星等药物敏感。

腐败梭菌危害及防治的研究进展

腐败梭菌是专性厌氧菌,它可引起多种疾病,对畜禽养殖有较大危害.为了探讨有效控制该菌危害的方法,对国内外有关腐败梭菌病原学、致病机理、感染途径及发病症状和防治措施等情况进行综述.

腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素的共表达及其免疫效力评价

为获得腐败梭菌α毒素和D型产气荚膜梭菌ε毒素的共表达产物,并鉴定其致死活性和反应原性,评价其免疫保护效力,利用PCR扩增腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素基因Gcsa和Gcpe并克隆至pETDuet-1质粒,转化E.coli BL21(DE3),自诱导培养基诱导这2段基因共表达;用SDS-PAGE和Western-blot以及小鼠毒性试验、抗毒素血清中和试验对表达产物进行鉴定;将诱导后的大肠杆菌灭活,制成铝佐剂疫苗1 m L/只皮下注射免疫家兔2次,测定免疫血清中和抗体效价,用1 MLD的腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素分别攻击。结果显示,所构建的E.coli BL21(pETDuet-Gcsa-Gcpe)可以同时表达Gcsa和Gcpe,表达产物能够与腐败梭菌和D型产气荚膜抗毒素血清反应;且具有小鼠致死毒性,只有用2种抗毒素一同作用,才能将其毒性中和;制成灭活疫苗免疫家兔,免疫血清对腐败梭菌毒素的中和抗体效价为2 MLD/0.1 m L,对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价≥50 MLD/0.1 m L;用2种毒素攻击,免疫组家兔全部保护,对照组全部死亡,达到《中华人民共和国兽药典》(2015版)效力检验标准。结果表明,所构建的表达载体可以实现α毒素和ε毒素的活性共表达,本研究为腐败梭菌和产气荚膜梭菌的多联基因工程灭活疫苗的研究提供了实验基础。

A case of gas gangrene in an immunosuppressed Crohn's patient

Clostridium septicum(C.septicum)gas gangrene is well documented in the literature,typically in the setting of trauma or immunosuppression.In this paper,we report a unique case of spontaneous clostridial myonecrosis in a patient with Crohn's disease and sulfasalazineinduced neutropenia.The patient presented with left thigh pain,vomiting and diarrhea.Blood tests demonstrated a profound neutropenia,and magnetic resonance imaging of the thigh confirmed extensive myonecrosis.The patient underwent emergency hip disarticulation,followed by hemicolectomy.C.septicum was cultured from the blood.Following completion of antibiotic therapy,the patient developed myonecrosis of the right pectoral muscle necessitating further debridement,and remains on lifelong prophylactic antibiotic therapy.

重组腐败梭菌α毒素的制备与免疫效力评价

为了对重组腐败梭菌α毒素的免疫效力进行评价,本研究以表达重组腐败梭菌α毒素的大肠杆菌BL21(pET28a-CSA)为研究对象,对影响重组腐败梭菌α毒素表达量的条件优化后,将重组腐败梭菌α毒素(分为上清分泌形式与包涵体形式)、超声波裂解和未裂解诱导后的全菌制成铝佐剂灭活疫苗皮下注射免疫家兔后,检测家兔血清中和效价,利用1 MLD腐败梭菌毒素攻击免疫家兔。结果显示,pET28a-CSA/BL21培养至OD_(600nm)达到0.850～0.950时以0.40 mmol/L IPTG,37℃诱导6 h获得的重组腐败梭菌α毒素相对表达量较高,并且以包涵体和可溶性2种形式表达且以包涵体居多;除包涵体疫苗组血清中和抗体效价为6 MLD/0.1 mL外,其它可溶性、裂解菌苗和未裂解处理菌苗实验组均为8 MLD/0.1 mL,高于类毒素疫苗组和《中国兽药典》规定的1 MLD/0.1 mL,攻毒后各免疫组家兔均得到100%保护,而类毒素疫苗组保护率仅40%,空白对照组全部死亡。结果表明,本研究制备的重组腐败梭菌α毒素具有很好的免疫保护效果,尤以可溶性的重组腐败梭菌α毒素免疫保护最佳。本实验为羊快疫疫苗的研制提供了实验基础。

大肠杆菌表达腐败梭菌α毒素及其产物的生物学特性鉴定

为了制备大肠杆菌源的重组腐败梭菌α毒素并对其生物学特性鉴定。利用PCR扩增α毒素基因,构建重组表达质粒pET32a-csa,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,对产物的反应原性、溶血活性、细胞毒性、小鼠致死毒性、毒力和毒性中和等生物学特性鉴定。结果显示,重组α毒素主要表达形式为包涵体,产物能够与腐败梭菌抗毒素血清反应,不能使绵羊红细胞发生溶血,具有细胞毒性和小鼠致死毒性,毒力超过300 MLD/mL,而且这种毒性可以被抗毒素中和。结果表明,通过大肠杆菌原核表达可以制备具有一定生物活性的重组腐败梭菌α毒素。

下肢败毒梭菌感染引起心源性猝死1例报告及文献综述

败毒梭菌是引起非创伤性气性坏疽病原菌之一,临床常见于肠道恶性肿瘤和血液肿瘤患者。如不给予积极治疗,其临床进展迅速,死亡率高。本文报告1例下肢败毒梭菌感染引起心源性猝死病例,以提高临床对该疾病的认识和治疗。

湖羊黑疫快疫的研究 Ⅰ.病原诊断

自１９６４年起，浙江杭嘉湖地区湖羊发生了一种高发病率高死亡率的急性传染病，仅３个县的不完全统计在一年内即死去一万余头，经病原学研究证明此病主要由水肿梭菌、黑疫的病原所引起，较少的病例是由水肿梭菌和腐败梭菌混合感染所致，后者是快疫的病原，研究工作早在３０年前结束，但迟至今日始发表。

致奶牛恶性水肿腐败梭菌的分离鉴定

为确诊某规模化奶牛场奶牛爆发恶性水肿死亡病例,采取病变组织触片染色,分离培养,分离菌形态观察,生化鉴定、实验动物接种、16SrRNA同源性序列分析鉴定。结果显示:病死牛肝触片染色菌体形态、分离株培养及菌体形态、生化反应均符合腐败梭菌特征;分离株PCR产物测序后与GenBank已发表的参考基因相应片段同源性比较,同源性为95.43%;分离株培养物经肌肉与腹腔分别接种豚鼠及小鼠后均引起死亡,肝触片染色镜检,其菌体形态与奶牛病例相同。结果表明,该奶牛场奶牛死亡系由腐败梭菌感染引起的恶性水肿所致。

绵羊(湖羊)黑疫快疫混合疫苗 Ⅱ.黑疫快疫混合疫苗研制

根据作者前文所报导的浙江省杭嘉湖地区发生的急性传染病的病原是水肿梭菌和腐败梭菌［１］。一种用于预防这两种病原的混合疫苗制造成功。经过几年在流行地区的应用，已控制了这种疫病。

产气荚膜梭菌β毒素和ε毒素以及腐败梭菌α毒素三联基因工程灭活疫苗的制备与免疫效力评价

为了获得高表达量的重组C型产气荚膜梭菌β毒素,鉴定其致死性和反应原性,并评价其与D型产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素共表达产物联合制成三联基因工程灭活疫苗的免疫保护效力。设计含不同酶切位点的2对引物,PCR扩增C型产气荚膜梭菌β毒素基因cpb1和cpb2,将二者克隆至pRSFDuet-1质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),自诱导培养基诱导2段基因共表达。用SDS-PAGE和Western-blot以及小鼠毒性试验、抗毒素血清和中和试验对表达产物进行鉴定。将诱导收获的大肠杆菌以及D型产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素的共表达产物1∶2配比灭活制成三联灭活铝佐剂疫苗,以每只1mL剂量皮下免疫家兔2次后,测定血清中和抗体效价,用1MLD的C、D型产气荚膜梭菌毒素和腐败梭菌毒素分别攻击。结果显示,所构建的重组大肠杆菌BL21(pRSFDuet-cpb1-cpb2)能够表达重组β毒素,产物能够与C型产气荚膜梭菌抗毒素血清反应,且具有小鼠致死毒性,抗毒素血清可以将其毒性中和;制成联合疫苗免疫家兔,免疫血清对C型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价为8MLD/0.1mL,对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价为45MLD/0.1mL,对腐败梭菌毒素的中和抗体效价为1.5MLD/0.1mL;用3种毒素攻击免疫组家兔均全部保护,对照组全部死亡,达到《中华人民共和国兽药典三部(2015版)》效力检验标准。本研究为羊猝狙、肠毒血症和快疫三联疫苗的研制提供了试验基础。

截短腐败梭菌α毒素的表达及其免疫原性评价

为了获得截短腐败梭菌α毒素并评价其毒性、反应原性和免疫原性,根据腐败梭菌α毒素的结构与功能,设计2对引物分别扩增含有穿孔活性区和受体结合区的α毒素基因csaN和csaC,克隆至pET-28a(+)质粒,构建截短α毒素表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导csaN和csaC表达,鉴定产物的反应原性和毒性,将经过诱导表达的工程菌灭活制成铝佐剂疫苗免疫家兔1次,通过血清中和试验和攻毒保护试验评价免疫效力,设立重组α全毒素rcsa免疫组作为阳性对照。结果显示,2个截短α毒素在大肠杆菌BL21(DE3)中均获得表达,产物能够与腐败梭菌抗毒素血清发生特异性反应,但失去了小鼠致死毒性。免疫家兔血清中和试验结果显示,csaN组血清的中和效价为1 MLD/0.1 mL,达到《中华人民共和国兽药典三部(2015年版)》效力检验的最低标准,csaC组为0,rcsa组为8 MLD/0.1 mL;csaN和csaC组家兔用1 MLD毒素攻击均未获得保护,而rcsa组家兔4/4获得保护。结果表明,截短α毒素与全毒素相比,失去了毒性但保留了反应原性,仅含穿孔活性结构区的截短部分具有较弱的免疫原性。

重组腐败梭菌α毒素的生物活性及其灭活疫苗的免疫效果

为了研究重组腐败梭菌α毒素的生物活性及其灭活疫苗的免疫效果,采用PCR法扩增腐败梭菌α毒素基因,构建重组表达质粒pET28α-csa,转化E.coli BL21(DE3);对表达产物的细胞毒性、小鼠致死毒力和抗毒素中和试验等生物活性进行鉴定,并将其制成灭活疫苗免疫家兔和靶动物绵羊,通过攻毒素试验和血清中和试验与类毒素疫苗进行比较。结果显示,重组α毒素能够与腐败梭菌抗毒素血清反应,具有细胞毒性,小鼠致死毒力超过300 MLD/mL,其毒性可以被腐败梭菌抗毒素中和。制成灭活疫苗免疫家兔,随着免疫剂量的增加血清中和效价随之提高,0.25 mL/只(含重组α毒素0.11 mg)免疫即可使家兔获得100%保护,免疫效果优于类毒素疫苗;0.50 mL/只(含重组α毒素0.22 mg)免疫绵羊攻毒保护率为75%。结果表明,重组腐败梭菌α毒素具有很好的生物活性,所制成的灭活疫苗可以作为预防羊快疫的候选疫苗。

腐败梭菌α毒素重组突变体的免疫保护力评价

本研究旨在获得腐败梭菌OL毒素（CSa）的重组突变体，并评价该重组毒素的毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌OL毒素编码基因进行优化设计，同时引入包括第86位半胱氨酸突变为亮氨酸及第296位的天冬氨酸、第301位的组氨酸和第342位的色氨酸突变为丙氨酸的4个氨基酸突变，经人工合成获得基因片段Gcsam4。将Gcsam4克隆至原核表达载体pET-30（＋）中进行表达与纯化，获得重组蛋白rcsam4。利用Western—blot检测rcsam4与腐败梭菌α毒素抗血清的反应性，并采用Vero细胞和小鼠检测其毒性。随后，将rcsam4与Montanide ISA206佐剂以1：1（v／V）的比例混合乳化制备疫苗并免疫家兔，按照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。二免后第21天对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的腐败梭菌毒素，来检测rCSam4对家兔的免疫保护效果。结果表明。rcsam4主要以包涵体的形式存在，且能够与腐败梭菌抗血清反应。Vero细胞毒性试验显示，9．85μg／mL的蛋白仍无细胞毒性：小鼠安全性试验显示，5．5×10^3μg／kg的剂量对小鼠无致死性；免疫rcsam4后，每毫升的一免兔血清可中和50~70个小鼠MLD的腐败梭菌毒素；每毫升的二免兔血清可中和110～130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素；1个家免MLD的腐败梭菌毒素攻毒后，对照组家兔全部死亡，免疫组家免得到了100％（4／4）的保护。以上结果表明，rcsam4在丧失毒性的同时还保留了良好的免疫原性,从而为腐败梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的试验数据。

腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素的融合表达纯化及其免疫效力评价

为了获得腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素融合蛋白并评价其免疫保护效力,试验采用PCR扩增方法将两种毒素融合基因ETX-CSA克隆至pvexk载体中,选取阳性克隆子转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,然后使用1%乳糖诱导阳性菌株进行蛋白质表达,通过SP阳离子柱纯化获得融合蛋白,通过SDS-PAGE、Western-blot验证融合蛋白的表达情况,通过将融合蛋白与佐剂混合配制成疫苗免疫家兔获取血清,然后使用免疫血清进行中和试验研究融合蛋白的免疫原性和免疫中和效应。结果表明:成功获得了可溶性表达的融合蛋白ETX-CSA,将纯化的ETX-CSA蛋白与佐剂混合配制成疫苗后免疫家兔所产生的血清对腐败梭菌毒素的中和效价达到1 MLD/0.1 mL(MLD为最小致死量),对D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价达到40 MLD/0.1 mL。说明融合蛋白成功表达,其具有免疫原性,免疫兔所产生的血清能够同时中和腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素。