Clostridium thermocellum与Clostridium beijerinckii偶联发酵玉米棒芯产丁醇

通过纤维小体产生菌Clostridium thermocellum ATCC 27405与产溶剂菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052的偶联培养,直接从木质纤维原料厌氧发酵生产丁醇。首先考察C.thermocellum在60℃下对玉米棒芯的降解情况,初始玉米棒芯浓度为50 g L-1。分阶段控制发酵pH,并在指数生长期内间歇补给55 g L-1玉米棒芯,C.thermocellum 120h内降解94.3 g L-1玉米棒芯,发酵上清液经稀硫酸水解后,测得总还原糖含量为37.4 g L-1,其中戊糖含量24.8 g L-1,葡萄糖含量5.28 g L-1。进一步研究C.thermocellum和C.beijerinckii偶联发酵,利用玉米棒芯生产总溶剂(丙酮、丁醇、乙醇)浓度达16.0 g L-1,其中丁醇产量高达8.75 g L-1。研究结果表明:该偶联发酵体系无须添加外源纤维素酶,并能同时发酵己糖和戊糖,具有实现生物燃料低成本生产的潜力。

嗜热细菌Clostridium thermocellum阿魏酸酯酶基因的克隆、异源表达及酶学特性分析

【目的】阐明嗜热细菌Clostridium thermocellum Xyn Z蛋白的阿魏酸酯酶催化域的酶学特性,为其在生物质能源及其它发酵工业中的应用奠定基础。【方法】分别构建了C.thermocellum Xyn Z的阿魏酸酯酶催化域(FAE)及该阿魏酸酯酶催化域和碳水化合物结合域(FAE-CBM6)编码基因的原核表达载体,并在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中异源表达,在此基础上分析比较了温度、pH、底物、金属离子及CBM6结合域对阿魏酸酯酶活性的影响。【结果】重组FAE酶及FAE-CBM6酶发挥催化活性的适宜pH值为5.0-9.0,适宜温度为50-70°C,它们对不同金属离子的响应有差异。【结论】在同一反应条件下,FAE-CBM6酶的酶活均比FAE高,说明CBM6结合域的存在对于阿魏酸酯酶活性有促进作用。

Clostridium thermocellum与Bacillus licheniformis共培养分解纤维素的性质

【目的】采取人工构建复合菌系的方法探索微生物协同降解纤维素的机理及菌间关系。【方法】从一组高温发酵木质纤维素原料产沼气的菌群中分离获得若干菌株,其中一株细菌经16S rRNA基因全序列测序比对后鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),将该菌株与厌氧纤维素分解菌Clostridium thermocellum CTL-6进行共培养,菌株组合表现出很强的滤纸纤维素分解能力。【结果】两菌共培养9 d,累计滤纸分解量为484.6 mg,滤纸相对分解率高达93.2%;pH变化呈先下降后逐步回升,培养3 d后pH由初始时的7.00降到最低值6.57,第9天升至7.73;菌株组合能同时产生纤维素酶和半纤维素酶,培养过程中两种酶活性大小均呈不断上升趋势,最大值分别为0.32 U/m L和0.57 U/m L。利用HPLC监测了乳酸、甲酸、乙酸、丙酸和丁酸5种有机酸含量的变化,其中丁酸、丙酸代谢量最高,分别为1 477.3 mg/L和1 068.8 mg/L;除丙酸外,其他4种有机酸含量变化趋势与滤纸降解的变化均无明显相关性。5种有机酸总含量的变化与p H的变化趋势一致,表明对pH变化起决定性作用的很可能是某种未检测的酸性较强的物质含量变化。【结论】Bacillus licheniformis能有效促进Clostridium thermocellum CTL-6的纤维素分解活性,且该菌株组合可作为后期进一步构建纤维素甲烷转化复合菌系的基础。

热纤梭菌耐热葡聚糖外切酶的克隆表达及酶学特性分析

研究旨在开发耐热纤维素酶,以提高畜禽对纤维素饲料的利用率和养殖经济效益。从蛋白质信息数据库UniProt中获取热纤梭菌(Clostridium thermocellum)葡聚糖外切酶CelS的序列信息,经信号肽删除和密码子优化,利用大肠杆菌表达系统,实现了CelS的过量表达。通过自诱导表达条件优化,有效提高了CelS可溶表达的比例。将胞内上清液通过镍离子亲和层析和热处理分离纯化获得可溶CelS,将胞内沉淀通过洗涤、变性和复性后获得包涵体复性CelS。酶学特性检测发现,两种表达形式CelS的酶活力无显著性差异,最适反应温度均为70℃,最适反应pH值为5.5~6.0,对无定形纤维素(PASC)的活性最高,对结晶纤维素(Avicel)和玉米秸秆(CS)次之。CelS与海栖热袍菌(Thermotoga maritima)葡聚糖内切酶EG12B协同作用水解CS,比单独水解酶活力提高了81.8%。试验结果表明,重组CelS表现出优越的耐热性能和纤维素水解活性,为进一步开发酶制剂提供了有力支持,有利于提高纤维素饲料的利用率。

热纤梭菌Cthe_2401蛋白功能预测及在大肠杆菌中的克隆表达与纯化

目的利用生信手段预测Cthe_2401蛋白的特性与功能,并在大肠杆菌中进行体外克隆、表达与纯化。方法利用国家生物技术信息中心数据库(NCBI)、蛋白保守结构域数据库(CDD)分析Cthe_2401蛋白的序列和进化特征,采用SWISS-MODEL在线软件进行同源建模并预测该蛋白的结构与功能;利用聚合酶链式反应(PCR)扩增Cthe_2401基因,并与pET28a载体链接构建pET28a-Cthe_2401表达质粒,转化大肠杆菌后利用异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导Cthe_2401蛋白表达;利用50%硫酸铵沉淀、Ni-NTA柱以及SephadexG75葡聚糖凝胶柱纯化Cthe_2401蛋白。结果生物信息学预测表明,Cthe_2401蛋白属于Veg蛋白家族,可能与生物膜的发生和孢子形成有关;Cthe_2401蛋白成功在大肠杆菌克隆与表达,体外纯化获得约10 ku大小的蛋白条带,与预期结果一致。结论成功预测Cthe_2401蛋白的功能,成功获得Cthe_2401蛋白在大肠杆菌中的克隆、表达与纯化。

热纤梭菌在生物质能源开发中的合成生物学研究进展

农林废弃物、能源植物、微藻等生物质是唯一同时具备“能源”和“物质”双重属性的可再生资源,在替代不可再生的化石能源方面具有巨大的潜力。木质纤维素生物转化的核心之一在于高效生物催化剂的构建。热纤梭菌是高效降解木质纤维素的嗜热厌氧菌,是多种木质纤维素生物转化策略的理想底盘菌株,在生物质能源开发中具有重要价值。经过近二十年的研究和开发,针对热纤梭菌已经建立了多种遗传改造技术,并构建了可以生产多种能源分子及化学品的热纤梭菌细胞工厂。本文首先介绍了热纤梭菌及其纤维素降解与利用特性,简述了热纤梭菌的系统生物学研究和遗传改造工具开发的现状,随后重点回顾和总结了热纤梭菌在生产乙醇、丁醇、异丁醇、氢气、乳酸、中/短链脂肪酸酯和可发酵糖等生物能源开发中的合成生物学研究进展。最后对热纤梭菌的合成生物学发展方向进行了展望,并强调了合成生物学技术在未来生物质能源开发中的重要作用。

不同组合微生物菌剂对牛粪堆肥效果的影响

为了探讨不同的微生物菌剂对牛粪堆肥的影响,该试验以80%牛粪+20%玉米秸秆为堆肥材料,设计4个堆肥处理,前3个处理组分别加入0.05%的菌剂A(黑曲霉+煎盘梭菌+普通高温放线菌)、0.05%菌剂B(黑曲霉+煎盘梭菌+热纤梭菌)和0.05%菌剂C(黑曲霉+煎盘梭菌),处理组4为不加菌剂的对照组,每个处理3个重复,经过31 d堆肥处理,以发酵温度、pH值、有机质含量、全氮含量和种子发芽指数5个指标进行跟踪测定。结果表明:菌剂A、B、C处理仅用1 d时间堆肥温度就升至50℃以上,高温阶段能持续时间分别为15 d、14 d、11 d便能完成发酵;发酵过程中菌剂A、B、C处理pH值基本低于对照组,pH值的变化呈现为下降、上升、下降至平稳的趋势。堆制第30 d与第0 d相比,所有处理的全氮含量比0 d时增加,对照组、菌剂A、B、C处理分别增加为11.01%、29.36%、33.94%和24.77%;所有处理组有机质含量均下降,对照组、菌剂A、B、C处理分别下降12.34%、26.14%、31.55%、19.88%。菌剂A、B、C处理的小白菜种子发芽指数达到74.63%以上,菌剂B处理最高达到97.73%。综合以上各项评价指标,菌剂B堆肥发酵效果优于菌剂A、C,菌剂B更适合牛粪堆肥发酵。

毛细管离子色谱-串联质谱法测定热纤梭杆菌发酵液中的低相对分子质量有机酸

建立了一种测定热纤梭杆菌发酵液中的低相对分子质量有机酸的毛细管离子色谱-串联质谱方法。探索优化了色谱和质谱的检测条件,在最佳分析条件下同时检测8种有机酸。离子色谱以KOH水溶液作为流动相进行梯度洗脱;用IonSwift MAX-100毛细管柱进行分离;在喷雾电压为3.0 kV、喷雾气压强为2 000 kPa、成源温度为275℃的条件下,选择离子监测(SIM)模式下运行质谱。结果表明,柠檬酸和异柠檬酸两种同分异构体能够得到很好的分离,8种有机酸在一定浓度范围内具有良好的线性关系,相对标准偏差为1.45%~5.99%,相关系数为0.9696~0.9986,平均加标回收率为89.0%~110.0%,8种有机酸的检出限为0.01~0.50 mg/L。该方法进样量少,灵敏度高,重现性好,能够满足实际样品的检测要求,可用于嗜热厌氧菌发酵液中低分子量有机酸的测定。

转化纤维素资源生成酒精的研究

研究了高温厌气的热纤梭菌(Clostridium thermocellum)转化纤维素物质直接生成酒精的过程,发酵产物除酒精外,还有乙酸、少量乳酸、H_2、CO_2和还原糖,还原糖的主要成份为木糖,纤维二糖和葡萄糖、诱变菌转化纤维素的能力与野生菌相比有明显提高,能发酵细小纤维、稻草和凤眼莲,酒精最大浓度可分别达4.0,3.2和9.3g/L。

二次回归正交组合设计与综合相关系数法对耐热纤维素酶基因工程菌发酵条件的优化与分析

目的:研究耐热纤维素酶基因工程菌的规模化生产。方法:采用二次回归正交组合设计试验对内切纤维素酶重组菌的发酵条件进行优化,利用综合相关系数分析法分析因素影响程度以及相对重要性。测定菌体生长的生物量、内切纤维素酶活性。结果:影响因素与纤维素酶活性间的二次回归方程为:Y2=45.858-1.653Z1-1.258Z2Z3-2.012Z12-1.499Z22-1.415Z32-1.719Z42,方差分析具有显著性。内切纤维素酶重组菌产酶的最佳发酵条件为:添加15.9g/L乳糖、10g/L麸皮、15g/L硫酸铵、5g/L玉米浆、1.0g/L碳酸钙;理论产酶量最好为46.5357U/mL;在诱导时间约为4h,实际实验酶产量达70.78U/mL。综合相关系数分析表明:4个影响因素的重要性依次为:诱导剂X1(乳糖)>氮源X3(硫酸铵和玉米浆)>钙质量浓度X4(碳酸钙)>碳源X2(麸皮),相互间通过交互对纤维素酶活性的间接影响都非常大,直接影响作用较小。结论:通过使用综合相关系数分析与二次回归正交组合分析,两者结合使用有互补性,能够较好地指导耐热纤维素酶基因工程菌发酵条件的优化。

嗜热厌氧梭菌直接发酵造纸污泥的基本特性

为有效利用造纸污泥中的纤维素和半纤维素,研究了嗜热厌氧梭菌Clostridiumthermocellum在不同底物特别是在造纸污泥中发酵的基本特性及相应的纤维素酶和木聚糖酶基本性质.结果表明:C.thermocellum能够直接发酵没有经过任何预处理的造纸污泥,具有作为生物联合加工(CBP)菌株的良好潜力;在化学制浆污泥中其乙醇产量最高达到7.41g/L,较商业纤维素中的乙醇产量提高了77.90%,纤维素酶酶活和木聚糖酶酶活最高分别达到1.92U/mL和1.30U/mL;在脱墨污泥里其发酵受到明显的抑制,乙醇产量只有1.31g/L,纤维素酶酶活和木聚糖酶酶活分别为1.64U/mL和0.90U/mL;纤维素酶最适温度为60℃,最适pH值为5.5;木聚糖酶最适温度为70℃,最适pH值为7.0;两种酶都表现出较强的金属离子适应性.

热纤梭菌转化木质纤维素产乙醇的研究进展

热纤梭菌是一种高效的、能直接分解纤维素的嗜热厌氧菌,其转化纤维素的主要产物有乙醇、乙酸、乳酸、CO2和H2等,是目前最有希望实现纤维素转化工业化的菌株之一。本文综述了热纤梭菌转化木质纤维素产乙醇的相关研究,涉及热纤梭菌的代谢途径、纤维素降解机制及其在合成乙醇方面的最新进展。

热纤梭菌纤维素酶的研究

本文对热纤梭菌ATCC27405和NCIB10682发酵所产生的纤维素酶的酶系比例，酶作用的最适温度和pH值以及产酶条件进行了研究。结果表明，在热纤梭菌的纤维素酶系中，C1酶、Cx酶和β-葡萄糖苷酶在这二菌株中的比值分别为1．0：8．4：27．9和1．0：6．4：14．7。酶作用的最适温度为55～60℃，pH值为6．1～7．7。同时发现这二菌株中的Cx酶具有较高的热稳定性。

耐热纤维素酶基因工程菌发酵条件优化

[目的]为耐热纤维素酶基因工程菌的规模化生产奠定基础。[方法]采用正交试验对内切纤维素酶重组菌的发酵条件进行优化,测定菌体生长的生物量、内切纤维素酶活性。[结果]结果表明,重组菌的最佳发酵条件为:添加10.0 g/L麸皮、10.0 g/L硫酸铵、10.0 g/L玉米浆、1.5 g/L碳酸钙,产酶量达69.42 U/ml。在重组菌产酶期添加20 g/L的乳糖时单位发酵液中的酶活性最高,是未优化前产酶量的2.1倍。[结论]研究耐热纤维素具有重要的实用价值。

嗜热梭菌内切纤维素酶的表达及其酶特性研究

通过PCR克隆了嗜热梭菌内切纤维素酶基因,该基因ORF为1947 bp,经Blast分析,该序列与嗜热梭菌同源性最高(93%),构建了内切纤维素酶大肠杆菌基因工程菌。SDS-PAGE电泳结果表明,在分子量77000左右有表达蛋白条带,该工程菌最适酶活性为90 U/ml,是出发菌的2.8倍,最适温度在60℃左右,最适pH为8。

热纤梭菌的分离和鉴定

用亨格特(Hungate)厌氧技术,从青贮燕麦草和牛粪中分离出7株热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)。它们的编号为 H3、H5、H10、H15、H17、H18和 H19。热纤梭菌在高温下有很强的发酵能力,并转化纤维素为乙醇和有机酸等有价值的产物,具有应用前景。这个种在已报道的高温厌氧分解纤维素梭菌中是比较重要且研究最多的一个种。本文报道该菌株的分离和鉴定。保藏号为 AS1.1783。

农业纤维素废物转化为酒精

利用热纤梭菌Clostridiumthermocellum可将农业纤维素废物转化为酒精。研究表明：热纤梭菌ATCC27405转化稻草、玉米秆、玉米叶可分别产酒精1．60，2.25，2．01g／L；热纤梭菌NCIB10682则为1.70，2.05，2．20g／L。利用ATCC27405诱变菌发酵稻草和凤眼莲，酒精最大浓度可达3．2和6．3g／L。

热纤梭菌发酵产物的分析

分析了热纤梭菌(Clostridium Thermocellum)ATCC27405和NCIB10682转化纤维素的产物.研究表明,热纤梭菌转化纯纤维素的产物主要有酒精、乙酸、还原糖、CO_2和H_2,还原糖成份为木糖、纤维二糖和葡萄糖.经ATCC27405转化后产生的木糖、纤维二糖与葡萄糖的比例为3.3:0.9:1;经NCIB10682转化后,则为7.9:3.2:1.

热纤梭菌内切β-1,4-葡聚糖酶的克隆与表达

将来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum)ATCC 27405的编码内切β-1,4-葡聚糖酶的结构基因(celD)与热激表达载体pHsh连接,得到重组表达载体pHsh-celD,并将重组表达载体pHsh-celD转入到大肠杆菌Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中。结果表明,该重组酶的分子质量为66 ku,与预期大小相符。基于表达载体pHsh的重组表达系统具有诱导表达简便、诱导方式廉价的优点,且重组酶热稳定性非常好,对该酶的大规模发酵应用具有重要意义。

梭热杆菌纤维小体研究进展

梭热杆菌(Clostridium thermocellum)是一种嗜热厌氧细菌,通过分泌大量纤维素酶高效降解纤维素。根据作用纤维素的不同部位,梭热杆菌分泌的纤维素酶分为内切纤维素酶和外切纤维素酶。纤维小体是由支架蛋白、锚定元件、黏合蛋白、纤维素结合域和催化单位组成的复合体,其独特的结构,使得它可以比真菌纤维素酶更紧密地结合到纤维素表面,这个复合结构结合着多种催化单位,而此特殊的结构是梭热杆菌高效降解纤维素的必要条件。近年来,为更深入透彻地了解纤维小体的结构与功能进行了大量的研究工作,现对相关研究进展进行综述,并给出了未来可能的发展方向。