肺炎链球菌毒力因子ClpP蛋白酶的体外表达及纯化

目的构建ClpP原核表达载体,获取原核表达的ClpP蛋白分子。方法分离培养TIGR4型肺炎链球菌,获取其染色体DNA,采用基因体外重组的方法将完整的ClpP读码框克隆到pET-32a原核表达载体,并经测序鉴定,所表达的抗原蛋白用Western blot鉴定,镍柱纯化并透析复性,真空冷冻干燥保存。结果测序结果证实克隆的基因与GenBank中的序列相符,Western blot证实获得了ClpP融合蛋白。结论获得了高表达的重组抗原蛋白,经镍柱纯化后纯度可达90%以上。

细菌ClpP蛋白酶功能及其抗菌药物靶点的研究进展

ClpP(Casein lytic proteinase P)是一种广泛存在于真核细胞和原核生物中的丝氨酸蛋白酶,可与多种类型AAA+(ATPase associated with various cellular activity)超家族ATP酶组成多种ClpP蛋白酶复合物,其主要功能是清除或降解细菌胞内合成不当、受损伤、变性聚集或无用的蛋白,并维持正常代谢和压力刺激下胞内蛋白质的动态平衡。近年研究表明,细菌ClpP可协助病原菌在宿主体内生存、繁殖和播散,ClpP在细菌致病过程中发挥重要作用,其相关致病机制也受到广泛关注。近年,细菌对抗生素耐药性不断增强,已严重威胁人类健康,ClpP蛋白酶因其独特的蛋白水解作用而成为抗菌药物研究的新靶点。本文综述了ClpP在不同病原体中的结构、分子功能和不同作用以及相应药物开发方面的研究进展。

ClpP蛋白酶研究进展:从细菌到人线粒体

Caseinolytic protease(ClpP)是一种包含丝氨酸蛋白酶催化三联体结构域的ATP依赖的蛋白水解酶,广泛存在于原核生物以及真核生物的线粒体和叶绿体中。它通常与AAA+家族的分子伴侣ClpX结合形成ClpXP蛋白酶复合物,AAA+家族成员能利用水解ATP提供的能量将蛋白底物去折叠,随后将底物分子转移至ClpP蛋白酶的水解腔体进行降解。ClpP蛋白酶对细胞内蛋白质量控制及维持体内稳态起到至关重要的作用。该文综述了近年来有关ClpP蛋白酶在结构、功能以及与细菌毒力的关系和有关药物开发等方面的研究。

结核分枝杆菌ClpP1重组蛋白的特性探讨及初步应用

目的用纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)ClpP1重组蛋白免疫新西兰白兔制备ClpP1多克隆抗体并检测其效价,间接ELISA法分析重组蛋白的抗原性,以初步评价其应用价值。方法通过SDS-PAGE确定ClpP1重组蛋白的主要表达形式,利用纯化包涵体方式对重组蛋白进行纯化;将纯化蛋白免疫新西兰白兔制备ClpP1多克隆抗体并检测其效价;再分别以纯化蛋白为抗原,制备抗体为一抗,间接ELISA法检测临床诊断结核病患者血清中抗M.tb抗体和M.tb抗原。结果 SDSPAGE显示ClpP1重组蛋白主要以包涵体表达形式存在,将纯化蛋白免疫新西兰白兔4次,取血测抗体效价为1∶64 000;Western blot结果显示制备抗体可较好的与ClpP1蛋白特异性结合;间接ELISA法结果表明,以重组蛋白为抗原测患者血清中抗M.tb抗体和以制备抗体为一抗测血清中的M.tb抗原的2实验组分别与对照组相比均具有显著性差异。结论制备了具有免疫原性的M.tb ClpP1重组蛋白及效价较高的多克隆抗体,并得出ClpP1多克隆抗体具有较好的免疫反应性,为进一步研究ClpP1重组蛋白的特性及其应用奠定了基础。

一种新型ATP-依赖型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因的克隆、表达和酶学特性

运用基因克隆技术,以分离鉴定获得的蛋白水解酶高活性类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)CHN26菌株的基因组DNA为模板,经克隆鉴定该菌株是一种新型ATP-依赖型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因,全长585 bp,编码194个氨基酸,分子量约为21 ku。采用大肠杆菌(Eschericia coli)pET表达系统构建PlclpP基因表达质粒pET-28-PlclpP,并在大肠杆菌BL21中实现了重组PlClpP蛋白的表达。利用组氨酸标签(His-tag)亲和纯化法获得Pl ClpP纯化蛋白,发现Pl ClpP可能与宿主菌未知伴侣分子形成蛋白复合物。PlClpP复合物具有ATP-依赖型酪蛋白水解酶活性,最适反应温度为40℃、pH值7.0。表面活性剂强烈抑制PlClpP复合物的酶活性,而常规丝氨酸蛋白酶抑制剂对其活性没有抑制作用。本研究结果为蛋白酶新基因资源的开发、ClpP家族蛋白酶的基础理论和应用研究奠定了基础。

一种新型ATP-依赖型ClpP家族蛋白质水解酶PlclpP基因的克隆、表达和酶学特性

运用基因克隆技术,以分离鉴定获得的蛋白质水解酶高活性类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)CHN26菌株基因组DNA为模板,克隆鉴定了该菌株一种新型ATP-依赖型Clp P家族蛋白质水解酶Plclp P基因(585 bp),编码194个氨基酸,蛋白质分子量约为2.1×104。采用大肠杆菌(Eschericia coli)p ET表达系统,构建了Plclp P基因表达质粒p ET-28-Plclp P,并在大肠杆菌BL21中实现了重组Pl Clp P蛋白质的表达。利用组氨酸标签(His-tag)亲和纯化法,获得了Pl Clp P纯化蛋白质,发现Pl Clp P可能与宿主菌未知伴侣分子形成蛋白质复合物。Pl Clp P复合物具有ATP-依赖型酪蛋白水解酶活性,最适反应条件为40℃、p H7.0。表面活性剂强烈抑制Pl Clp P复合物的酶活,而常规丝氨酸蛋白酶抑制剂对其活性无抑制作用。

变异链球菌的htrA和clpP基因对其生长和饥饿耐受的影响

目的:观察变异链球菌(下称变链菌)htrA-clpP双基因缺陷株的生长特点;比较缺陷株与标准株在饥饿条件下生长情况的差异。方法:将两菌株分别培养在含有10 g/L葡萄糖及无碳源的TPY培养基中,37℃微需氧条件下培养,从接种入培养基开始以2 h为间隔采用酶联免疫检测仪在600 nm下测定各菌株在两种生长条件下的生长曲线并比较其生长情况的差异,同时在各时间点使用葡萄糖氧化酶法试剂盒测定在含葡萄糖培养基中生长的两菌株耗糖情况并比较其差异。结果:①缺陷株在含10 g/L葡萄糖和无碳源TPY培养基中生长时,生长周期都发生了改变,对数期峰值提前且此阶段生长速度较标准株快(P<0.05),而标准株的对数期峰值及平台期A值均明显高于缺陷株(P<0.05);②标准株和缺陷株在无碳源条件下生长时细胞的生长能力较葡萄糖条件下明显降低(P<0.05);③缺陷株消耗葡萄糖的速度较标准株快(P<0.05)。结论:htrA和clpP基因缺陷可在一定程度上导致变链菌的生长及抗饥饿能力降低。

牙龈卟啉单胞菌FtsZ降解试验模型-clpP基因缺失株的构建

目的 建立牙龈卟啉单胞菌分裂关键蛋白FtsZ （FtsZPg）体内降解试验模型,即构建蛋白酶编码基因clpP缺失的E.coli MG1655.方法 将一段两端含靶基因同源臂的PCR产物电转入L-阿拉伯糖诱导后表达λ噬菌体重组蛋白、具有较强重组能力、含质粒pKD46的菌株E.coli MG1655感受态细胞,以PCR产物中的氯霉素抗性基因替代靶基因.结果 利用氯霉素抗性平板筛选阳性重组体,得到E.coli MG1655的ClpP蛋白酶基因敲除突变株.通过琼脂糖凝胶电泳和DNA测序最终鉴定阳性clpP基因缺失株.结论 本试验成功构建了E.coli MG1655 clpP敲除株;该敲除株有望在探讨重要牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌分裂关键蛋白FtsZPg与蛋白酶clpP的关系中发挥一定作用.

酪蛋白水解酶ClpP的结构研究与功能干预

酪蛋白水解酶ClpP是一种高度保守的丝氨酸蛋白水解酶,通常与AAA+超家族ATP酶的伴侣蛋白形成复合物调控细胞内蛋白质稳态.化学干预ClpP蛋白水解酶的生物学功能,尤其是小分子激动剂的开发已被证明是治疗多种疾病的有效策略.近年来,本课题组围绕ClpP蛋白酶在结构生物学和化学生物学等研究领域取得了一些重要进展.一方面,通过结构生物学方法解析了金黄色葡萄球菌ClpP(SaClpP)不同状态下的三种构象的晶体结构;并发现SaClpP的功能激活型突变体,增加了对ClpP激动机制的理解.另一方面,针对病原菌和人线粒体ClpP开展小分子激动剂的化学干预研究,开发多类型骨架的ClpP小分子激动剂,实现对不同物种ClpP蛋白酶功能选择性激动,推动以ClpP为靶标的抗菌和抗肿瘤研究.

ClpP融合蛋白诱导的免疫反应可抵抗不同型别肺炎链球菌的侵袭性感染

目的ClpP融合蛋白在调节肺炎链球菌其他毒力因子表达和入血过程中起重要作用，评价Trx—ClpP融合蛋白对不同型别肺炎链球菌的侵袭性感染的免疫保护效果，为后续蛋白疫苗的开发提供依据。方法含有重组质粒pET-32a（＋）／ClpP工程菌B121（DE3）经IPTG诱导后表达Trx—ClpP融合蛋白，纯化后与铝佐剂？昆合经腹腔注射免疫小鼠，而对照小鼠则用PBS与铝佐剂混合免疫。免疫程序：初次免疫5周后用ELISA法测小鼠针对ClpP融合蛋白的抗体免疫应答水平，末次免疫2周后用12个型别肺炎链球菌攻击，监测其生存时间。结果重组ClpP融合蛋白主动免疫BALB／c小鼠后，产生了高滴度的anti—ClpP融合蛋白抗体，对多个血清型的肺炎链球菌菌血症小鼠模型的保护效果较对照组具有统计学意义。结论ClpP融合蛋白免疫小鼠后可抵抗1、2、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F等12个型别的肺炎链球菌侵袭性感染，提示以ClpP融合蛋白为活性成分的疫苗具有较高的开发价值。

结核分枝杆菌Rv2460c基因的克隆,表达及编码产物的免疫特性分析

目的:对结核分枝杆菌Rv2460c基因(编码Clp P2蛋白)进行克隆,表达,并评价其编码产物的免疫原性。方法:扩增结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)H37Rv的Rv2460c基因,构建重组质粒p ET32a(+)-Clp P2,用IPTG诱导表达,利用亲和层析法进行纯化。用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白Clp P2的表达和鉴定。用生物信息学对Mtb Clp P2的免疫原性分析和表位预测。酶联免疫吸附法(ELISA)测定兔和TB病人血清anti-Clp P2滴度。结果:重组Clp P2蛋白酶在大肠杆菌中以包涵体形式表达,经bandscan软件分析纯化蛋白的纯度为93%。生物信息学分析Mtb Clp P2蛋白具有多个优势B细胞表位和T细胞表位。ELISA法测定兔抗血清效价为1∶64 000;检测肺结核病人血清中anti-Clp P2抗体水平高于健康对照人群。结论:成功纯化了重组蛋白Clp P2和制备了特异性兔抗Clp P2多克隆抗体,实验和信息学均表明Mtb Clp P2蛋白酶有较强的免疫原性。

ClpP免疫小鼠可抵抗TIGR4型肺炎链球菌的侵袭性感染

目的原核表达肺炎链球菌毒力因子ClpP，探讨其作为肺炎链球菌候选蛋白疫苗的价值。方法分离培养TIGR4型肺炎链球菌，获取其染色体DNA，采用基因体外重组的方法将完整的ClpP开放读码框架克隆到pET-32a原核表达载体内，经测序鉴定、原核表达及纯化，ClpP主动和阳性抗体血清被动免疫小鼠，TIGR4型肺炎链球菌攻击后，监测其生存时间。结果获得了高表达的重组抗原蛋白，表达的抗原蛋白用Western blot鉴定，镍柱纯化并透析复性可得到纯度达90％以上的重组蛋白。主动和被动免疫BALB／c小鼠，与未免疫组相比，产生的保护性作用具有统计学意义。结论ClpP蛋白免疫小鼠可抵抗肺炎链球菌侵袭性感染，ClpP蛋白可作为肺炎链球菌的候选蛋白疫苗。

结核分枝杆菌Rv2461c基因的克隆、表达、纯化及其抗原性的初步检测

目的:探索结核分枝杆菌Rv2461c基因编码的clpP蛋白作为结核检测抗原的可行性。方法:克隆结核分枝杆菌clpP蛋白的编码基因Rv2461c,构建pET30a-Rv2461c重组质粒,并将其成功的转化到大肠杆菌JF1125克隆载体中,测序鉴定结果正确。将pET30a-Rv2461 c重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,表达纯化目的蛋白进行质谱分析.制备clpP蛋白的多克隆抗体,通过亚细胞分离及Western检测分析蛋白的亚细胞定位,纯化的clpP蛋白通过间接ELISA实验进行抗原性的初步检测。结果:结核分枝杆菌clpP蛋白大量存在于细胞质中,少量存在于细胞壁和细胞膜中。重组抗原在检测肺结核病人中的检出率为38.3%(23/60),检测敏感性为38.3%,特异性为90%。结论:为后续深入研究clpP蛋白的生物功能、clpP作为诊断靶标、药靶候选蛋白的可行性提供了基础。

线粒体ClpP激动剂抗肿瘤的研究进展

线粒体是执行和协调细胞内多种代谢和生命活动的重要细胞器。线粒体功能障碍严重影响细胞的健康,导致神经退行性疾病、心血管疾病以及肿瘤等的发生。线粒体内受损的蛋白或者错误折叠的蛋白堆积会引发整合应激反应和未折叠蛋白反应,线粒体通过蛋白酶体清除异常蛋白从而维持线粒体蛋白质平衡。其中,线粒体丝氨酸蛋白酶ClpP通过与其天然分子伴侣ClpX结合,降解异常蛋白来维持线粒体的正常功能。研究表明,在肿瘤细胞中ClpP高表达,干扰ClpP的蛋白水平导致肿瘤细胞的死亡,且ClpP对肿瘤细胞的生长增殖、侵袭和迁移性能都十分重要,因此ClpP可作为肿瘤病人潜在的药物治疗靶点。近年来,通过靶向激活ClpP的小分子在多种小鼠异种移植肿瘤模型中治疗效果显著,其中以ONC201为代表的Imipridone类化合物因其优异的抗肿瘤作用和安全性已被批准用于临床Ⅲ期试验。在这篇综述中,作者全面概述了ClpP的结构、生理学功能和已报道的小分子激动剂发挥抗肿瘤效应的不同作用机制的相关研究。最后,作者讨论了新型选择性靶向ClpP治疗的小分子化合物的机遇与挑战。