菊花CmDREBa-2基因的功能验证

为探究CmDREBa-2基因的抗性功能,了解CmDREBa-2调控菊花参与高、低温防御反应及响应白色锈病的分子机制,构建了过表达载体pBI121-CmDREBa-2,利用农杆菌介导法转化菊花'C029'。对转基因植株进行45℃高温、-4℃低温及接菌处理后,观察表型并分析下游基因表达量。结果表明:PCR检测共获得2个阳性植株,半定量与qRT-PCR表明CmDREBa-2成功高表达。在45℃的高温胁迫处理下,转基因株系存活率显著高于野生型,并显著提高了热胁迫基因CmHsp90、CmHsfA2、活性氧清除基因SOD的表达。低温胁迫处理下,转基因株系OE-5,OE-8的存活率分别为90%和85%,而野生型仅为10%,同时,抗寒相关基因COR413、COR6.6和抗逆基因rd29a的表达较处理前升高,且高于野生型。接种白色锈病病原菌32h时,转基因株系中CmDREBa-2的表达量激增,同时CmDREBa-2的过表达也不同程度地促进了病程相关基因PR1和PDF1.2的表达。其中,PR1基因的表达更为明显。综上,CmDREBa-2可能直接或间接调控胁迫相关基因增强菊花对高温胁迫和低温胁迫的耐受性。CmDREBa-2通过SA介导的抗病信号途径,参与菊花抵抗白色锈病反应。

菊花抗白色锈病相关基因CmDREBa-2的克隆及表达分析

以菊花(Chrysanthemum morifolium)免疫白色锈病品种‘C029’为试验材料,基于白色锈病病原菌诱导的菊花转录组数据库,采用RACE(rapid-amplification of c DNA ends)方法克隆得到菊花DREB(Dehydration responsive element binding protein)基因,命名为CmDREBa-2。对其进行生物信息学分析和表达分析,结果表明:CmDREBa-2开放阅读框(ORF)全长291 bp,编码96个氨基酸;预测CmDREBa-2蛋白相对分子质量为11 159.04,p I为11.34,是一个定位于细胞核、亲水的不稳定蛋白;氨基酸序列和结构分析显示该蛋白含有1个由49个氨基酸残基组成的AP2保守结构域,所以该蛋白属于AP2/EREBP家族;进化树分析表明Cm DREBa-2属于DREB家族的A-1组,CmDREBa-2蛋白与菊花的其他两个DREB类蛋白Cm DREBa和CmDREBb的同源性较高;菊花‘C029’接种白色锈病病原菌6 h后,CmDREBa-2表达量达到最高,约为未接菌对照的34倍;用水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(Me JA)和乙烯利(ETH)处理‘C029’菊花叶片,结果表明CmDREBa-2受3种激素的诱导表达。