新型隐球酵母U6启动子的鉴定、克隆及功能验证

【目的】鉴定及克隆新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)中PolⅢ型的U6启动子(Cn U6启动子),并验证CnU6启动子能否有效转录shRNA及CRISPR/Cas9系统中gRNA。【方法】结合Gen Bank数据库已公布的新型隐球酵母基因组信息和本实验室RNA-seq文库数据,利用生物信息学技术分析得到新型隐球酵母中具有高转录水平的U6RNA序列。使用重叠PCR和Easy Geno方法将预测的CnU6启动子分别克隆到sh RNA及gRNA的上游区域,通过观察shRNA对靶基因的RNAi效果及gRNA引导Cas9核酸酶对靶位点的切割结果,确定CnU6启动子能否转录短RNA。【结果】CnU6启动子能够转录形成shRNA对靶基因进行沉默,并且能转录形成g RNA引导Cas9核酸酶对靶点进行切割。【结论】新型隐球酵母的CnU6启动子被成功鉴定及克隆,它能有效驱动shRNA和gRNA的转录。