钙调素蛋白磷酸酶对Slingshot-1L的调控作用

目的探讨钙调素依赖蛋白激酶(Calcinenurin/PP2B/CnA/Cn)对Slingshot-1L(SSH-1L)活性的调控作用。方法用脂质体法将含YFP-SSH-1L的重组质粒转染至MG63细胞,经钙离子载体A23187诱导10min,进行免疫细胞化学染色,观察细胞形态变化;体内及体外实验检测PP3B对SSH-1L的活性调控作用;应用免疫共沉实验检测PP2B与SSH-1L的相互结合情况。结果Ca2+信号诱导骨肉瘤细胞形成伪叶,同时SSH-1L与F-actin移位共聚集至细胞膜伪叶,但是被PP2B有效抑制剂Cypermethrin完全阻断;在体外,SSH-1L磷酸酶活性测定实验以及SSH-1L与PP2B结合实验证实SSH-1L与PP2B在细胞内是一对相互结合的蛋白质,同时PP2B具有促进SSH-1L酶活性的作用。结论PP2B通路对细胞伪叶的形成及细胞运动具有重要调控作用,同时对SSH-1L酶具有促进其活性的作用。

金黄色葡萄球菌Cna基因的生物信息学分析及原核表达

[目的]对金黄色葡萄球菌的Cna基因进行生物信息学分析,并进行克隆和原核表达,为金黄色葡萄球菌重组疫苗的研发提供参考数据。[方法]使用Protparam、PSORT、Signal P-5.0、TMpred、Net Phos 3.1 Server、PSIPRED、SWISSMODEL等在线生物信息软件,分析Cna蛋白的理化性质、亚细胞定位、跨膜区域、磷酸化修饰位点、二级结构和三维结构。以基因组DNA为模板扩增Cna基因编码N1-N2子域的片段,扩增产物经酶切回收后与载体pET-32a(+)相连接,构建重组表达质粒,将该重组质粒转化E.coli TG1,经菌落PCR、测序鉴定后,增菌培养并抽提质粒,再转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析。[结果]Cna蛋白由1 183个氨基酸残基组成,相对分子质量为133 006.82 Da,等电点为5.89,负电荷氨基酸残基数为180个,正电荷氨基酸残基数为167个,分子式:C5863H9241-N1569O1936S10,原子总数18 619个,是一种稳定的亲水蛋白质,定位于细胞膜上,第4~23、1 158~1 177位氨基酸残基分别形成一个典型的跨膜区,具有148个潜在的磷酸化修饰位点,二级结构中无规则卷曲和β折叠占较大比例,三维结构与二级结构预测结果相符。成功构建了重组表达质粒pET-32a(+)-Cna,经IPTG诱导后重组蛋白(N1-N2子域)获得了表达,重组蛋白相对分子质量为52.1 kDa。[结论]Cna基因的生物信息学分析及该基因的成功表达,为研究Cna蛋白在免疫保护中的作用奠定了一定的基础。