滇龙胆乙酰CoA转移酶基因的克隆与表达分析

根据滇龙胆转录组乙酰CoA酰基转移酶基因GrAACT序列设计引物,使用逆转录PCR(RT-PCR)技术从滇龙胆幼叶扩增该基因,并进行序列分析、原核表达和组织特异性分析。结果表明:GrAACT基因(登录号KJ917163)开放阅读框长1 215 bp,编码404个氨基酸;GrAACT蛋白相对分子质量41.41 ku,p I值为6.25,属于AACT蛋白家族成员,无信号肽,为疏水稳定蛋白,主要由α-螺旋、无规则卷曲构成;GrAACT蛋白具有AACT蛋白保守结构域:硫解酶N端结构域(第12~272位氨基酸)、硫解酶C端结构域(第282~402位氨基酸)、类硫解酶结构域(第13~403位氨基酸);在硫解酶C端结构域中,包含硫解酶保守位点(第350~366位氨基酸)、硫解酶活性位点(第385~398位氨基酸);滇龙胆GrAACT蛋白与长春花CrAACT蛋白亲缘关系最近;GrAACT基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为67.41 ku;组织特异性表达分析结果表明,GrAACT基因主要在茎、根中表达。

油茶乙酰CoA酰基转移酶基因cDNA克隆及序列特征分析

在已知油茶乙酰COA酰基转移酶基因EST序列基础上,设计6条特异引物,以油茶优良无性系‘湘林1号’种仁总RNA为模板,通过反应体系和反应条件优化,最终扩增出一条700 bp左右的目的片段,将该片段回收、克隆、测序,获得718 bp的cDNA序列,将该序列与油茶乙酰COA酰基转移酶基因进行序列拼接,确定了油茶乙酰COA酰基转移酶基因的全长cDNA序列,将该序列提交至GeneBank,登录号为GU594059。油茶乙酰COA酰基转移酶基因全长cDNA序列为1 495 bp,含有一个1 227 bp的ORF,编码408个氨基酸残基。在氨基酸序列水平上,该基因与胡黄连(P.kurrooa)的乙酰COA酰基转移酶基因的相似性最高,为86%,与稻瘟病菌(M.grisea)的最低,为65%。通过在线预测,油茶乙酰COA酰基转移酶基因编码蛋白的等电点pI为6.19,分子量Mw为41 628.6 Da。本研究为揭示油茶油脂合成规律和油茶的分子育种提供了理论依据和科学基础。

甲基丙二酰CoA羧基转移酶对泰乐星合成的影响

对不同碳源条件下泰乐星发酵过程中甲基丙二酰ＣｏＡ羧基转移酶的活力进行了测定。发现发酵过程中甲基丙二酰ＣｏＡ羧基转移酶的比活力与泰乐星形成速率有关，即该酶的活力高，泰乐星的形成速率大，说明甲基丙二酰ＣｏＡ羧基转移酶是泰乐星合成中的一种关键酶。另外，菜籽油为碳源条件下测得的甲基丙二酰ＣｏＡ羧基转移酶的活力比淀粉为碳源条件下该酶的活力高，此结果从酶活水平分析了菜籽油为碳源可提高泰乐星产量的原因。

苯丙氨酸CoA酰基转移酶原核表达系统的构建和表达

目的 :获得大量的重组红豆杉苯丙基转移酶 (BAPT) ,为紫杉醇半合成代谢提供廉价的催化剂。方法 :根据DNA重组技术 ,构建原核表达载体pET -BAPT ,使目的基因位于原核T7启动子下游 ,IPTG诱导基因表达。结果 :BAPT高效表达 ,重组蛋白主要以包涵体的形式存在。结论 :为获得可溶性重组蛋白BAPT奠定了理论基础。

菜油对弗氏链霉菌甲基丙二酰CoA羧基转移酶活性的影响

大环内酯类抗生素泰洛星(tylosin)在养猪业上用作生长促进剂,并作为兽药用于治疗由革兰氏阳性菌和枝原体所引起的感染.对泰洛星的生物合成及其调节已研究多年.最近有关泰洛星生物合成途径的发现,使研究该途径所包含的酶以及任何可提高泰洛星产量的信息成为可能.泰洛星具有16元分支的内酯环,其生物合成需要3种前体:5个丙酸,2个乙酸。

茅苍术乙酰辅酶A酰基转移酶基因(AlAACT)的克隆与序列分析

目的:对茅苍术乙酰辅酶A酰基转移酶基因(AlAACT)全长进行克隆,并分析其序列特征,为后期解析茅苍术萜类次生代谢产物的生物合成机制提供实验依据。方法:根据转录组测序所得的AACT基因片段设计引物,利用逆转录PCR技术获得全长cDNA序列,并采用生物信息学手段分析其序列特征。结果:克隆获得AlAACT基因的全长cDNA序列为1227 bp,编码408个氨基酸,理论相对分子质量为41.98 kDa,等电点为5.82,不存在跨膜区以及信号肽,为亲水性蛋白,具有多个磷酸化位点。进化树分析发现AlAACT基因与其他植物AACT基因具有较高相似性,尤其是菊科蓟属植物洋蓟,表明该基因保守性高。结论:成功获得茅苍术AlAACT基因序列,并掌握其序列特征,为后续深入研究该序列在茅苍术萜类化合物合成途径中的功能提供了必要的实验基础和理论依据。

ACAT1和MTNR1B基因多态性与非酒精性脂肪性肝病易感性的关系

目的本研究拟探讨乙酰辅酶A乙酰转移酶1(ACAT1)和褪黑激素受体1B(MTNR1B)基因多态性与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)疾病易感性的关系。方法本研究共纳入2020年12月—2022年6月就诊于青岛市市立医院的健康体检者164例、NAFLD患者228例。采用PCR及测序的方法对ACAT1 rs1044925、rs1157651和MTNR1B rs10830963基因多态性进行基因分型,并采集空腹静脉血进行生化检测。符合正态分布的计量资料两组间比较采用成组t检验;非正态分布的计量资料两组间比较采用Mann-Whitney U非参数检验;计数资料两组间比较采用χ2检验。结果ACAT1 rs1044925、rs1157651和MTNR1B rs10830963基因型分布在NAFLD及健康对照组间无统计学差异(P值均>0.05),ACAT1 rs1044925 AA基因型携带者的LDL水平明显高于C等位基因携带者(Z=−2.08,P=0.04),MTNR1B rs10830963 G等位基因携带者空腹血糖水平明显高于CC基因型携带者(Z=−3.01,P<0.01)。结论ACAT1 rs1044925、rs1157651和MTNR1B rs10830963多态性与NAFLD易感性无明显相关,ACAT1 rs1044925和MTNR1B rs10830963位点分别与LDL和空腹血糖水平有关。

IL-1通过PKC/MAPK激活蛋白激酶通路上调泡沫细胞ACAT-1的表达及活性

目的研究白细胞介素1(IL-1)是否通过蛋白激酶C/丝裂原激活蛋白激酶(PKC/MAPK)信号通路上调泡沫细胞中脂酰CoA胆固醇酯酰转移酶-1(ACAT-1)的表达及活性。方法复苏并培养人单核细胞白血病细胞系/THP-1细胞,与200 nmol/L乙酸肉豆蔻佛波酯(PMA)共孵育48 h,再与氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)共孵育24 h,油红O染色观察胞质内脂质沉积;分别以非放射性酶法和Western blot检测细胞中PKC和MAPK活性;加入PKC和MAPK抑制剂后,以Western blot及液相闪烁计数法检测ACAT-1的蛋白表达及酶活性。结果与PMA共孵育48 h后,THP-1细胞逐渐伸出突起,由圆形、悬浮式生长转变为多角形、梭形,呈阿米巴样贴壁生长;经Ox-LDL诱导24 h后,油红O染色胞质内可见大量吞噬的脂质小滴。与泡沫细胞组相比,泡沫细胞加IL-1组PKC活性、MAPK活性、ACAT-1蛋白表达及活性增加(P<0.05);ACAT-1蛋白表达由4.92±0.11增至5.95±0.12(P<0.05);PKC抑制剂和MAPK抑制剂能显著抑制IL-1上调ACAT-1表达(P<0.05)及活性(P<0.05)的作用。结论 IL-1上调泡沫细胞ACAT-1表达及活性,其作用是通过PKC/MAPK信号通路途径实现的。

丹参乙酰CoA酰基转移酶基因全长克隆和SNP分析

乙酰CoA酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase,AACT)为萜类化合物生物合成甲羟戊酸(MVA)途径的起始酶,催化使2个分子的乙酰CoA缩合为乙酰乙酰CoA。利用基因芯片结合RACE方法,从丹参毛状根中得到一个AACT基因(SmAACT,accession No.EF635969),该基因全长1623bp,含有1个1200bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码399个氨基酸,对应基因组序列含有9个内含子。序列同源性分析和分子进化分析表明SmAACT是一种与植物类异戊二烯MVA途径相关的蛋白,其表达量受到生物和非生物诱导子酵母和Ag+的诱导,并伴随丹参酮类成分积累。在丹参根、茎、叶中均有表达,根中的表达量明显高于茎和叶中的表达量。单核苷酸多态性分析表明,在第6至第9内含子约600bp范围内,SmAACT共存在33个多态位点,且表现出产地特异基因型。该基因的克隆分析为研究丹参酮类成分的次生代谢调控机制奠定了基础。

独行菜幼苗叶片乙酰CoA酰基转移酶基因克隆、序列分析与原核表达

目的:研究独行菜强心苷生物合成途径的相关基因,从独行菜幼苗叶片中克隆强心苷生物合成途径关键酶乙酰CoA酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase,AACT)基因,进行序列分析和原核表达。方法:根据独行菜转录组数据中LaAACT基因序列设计特异性引物,克隆得到LaAACT基因的cDNA序列,构建pET-32a-LaAACT原核表达载体,诱导表达LaAACT重组蛋白。结果:LaAACT基因ORF全长为1 212 bp,编码403个氨基酸。序列分析结果显示LaAACT蛋白没有跨膜区,不含信号肽,位于细胞质中,含有硫解酶家族保守结构域。系统进化结果显示LaAACT蛋白与十字花科植物的AACT蛋白亲缘关系较近。通过IPTG诱导,在大肠埃希菌中成功表达LaAACT重组蛋白,并得到了纯化的LaAACT重组蛋白。结论:首次从独行菜幼苗叶片中克隆了LaAACT基因,建立其稳定的原核表达体系,为LaAACT蛋白抗体的制备,进一步研究LaAACT基因在独行菜强心苷生物合成途径中的功能奠定了基础。

泡沫细胞形成过程中酰基CoA:胆固醇酰基转移酶1活性改变及其机制研究

目的 研究人单核细胞系在分化为巨噬细胞及转化为泡沫细胞过程中酰基CoA :胆固醇酰基转移酶 1(ACAT1)活性的改变及其机制。方法 体外培养人THP 1单核细胞系 ,由佛波酯作用使其分化为巨噬细胞 ,后者再由氧化低密度脂蛋白 (Ox LDL)进一步作用转变为泡沫细胞。此过程中以放射性同位素标记底物法检测ACAT1活性的变化 ,并用Westernblot法检测ACAT1蛋白的表达及RT PCR法检测ACAT1mRNA的水平。结果 在单核细胞分化为巨噬细胞的过程中ACAT1活性升高了 2倍 ,差异具有显著性 (P <0 0 5 ) ,酶蛋白及mRNA水平呈现类似变化趋势 ,在进一步转化为泡沫细胞过程中 ,ACAT1活性、酶蛋白及mRNA仍处于较高水平 ,但与巨噬细胞相比差异无显著性。结论 单核细胞分化为巨噬细胞的过程中ACAT1转录水平的上调导致酶蛋白量合成增加 ,从而使ACAT1活性也大为增强 ,而Ox LDL对ACAT1活性影响则不明显。

雷公藤乙酰CoA酰基转移酶基因全长cDNA克隆及表达分析

研究根据雷公藤悬浮细胞转录组数据库设计引物,对雷公藤悬浮细胞乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-Co A C-acetyltransferase)基因Tw AACT进行全长c DNA(Gene Bank:KP297934)克隆以及生物信息学分析和基因表达分析。克隆得到Tw AACT c DNA全长为1 704 bp,编码405个氨基酸,等电点为6.10,相对分子质量为41.20 k Da,在线预测表明Tw AACT具有2个催化活性位点。雷公藤悬浮细胞经茉莉酸甲酯(Me JA)外源诱导后,通过荧光定量PCR表明,Tw AACT相对表达量明显增加,在24 h达到最高。研究首次克隆得到雷公藤AACT基因,为进一步阐述雷公藤萜类生物合成途径奠定基础。

β-酮硫解酶缺乏症3例患儿的临床及遗传学分析

目的探讨3例β-酮硫解酶缺乏症(BKTD)患儿的临床特征和基因变异。方法回顾性分析河南省儿童医院2018年1月至2022年10月诊治的3例BKTD患儿的临床表现、实验室检查及基因检测资料,分析其临床和基因变异特点。结果3例患儿均为男性,年龄为7~11个月,表现为外伤应激、感染后出现精神差、气促、呕吐、抽搐等,均存在重度代谢性酸中毒、血和尿中酮体升高、低血糖、血异戊烯酰肉碱和3-羟基异戊酰肉碱升高、尿2-甲基-3-羟基丁酸和甲基巴豆酰甘氨酸增多。基因检测提示患儿1的ACAT1基因存在c.1183G>T杂合变异与1个涉及ACAT1基因的大片段缺失(chr11:102980303_110501515),患儿2的ACAT1基因存在c.121-3C>G与c.826+5_826+9delGTGTT复合杂合变异,患儿3的ACAT1基因存在c.928G>C与c.1142T>C复合杂合变异。患儿2与患儿3的4种变异均为已知的致病性或可能致病性变异。根据美国医学遗传学与基因组学学会变异相关指南,患儿1的c.1183G>T被评级为意义不明变异(PM2_Supporting+PP3+PP4),11q22.3-11q23.1大片段缺失查询DGV正常人群拷贝数变异数据库未见收录,被评级为致病性拷贝数变异。结论ACAT1基因的变异考虑为3例BKTD患儿的遗传学病因。

IL-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1 mRNA表达的影响

目的:研究IL-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1 mRNA表达的影响。方法:(1)复苏并培养人单核细胞株THP-1细胞并诱导为巨噬细胞和泡沫细胞。(2)RT-PCR法检测A-CAT-1 mRNA在单核细胞、巨噬细胞、泡沫细胞以及泡沫细胞加IL-1和泡沫细胞加IL-1/IL-1单克隆抗体中的表达。结果:(1)单核细胞株THP-1细胞被诱导为巨噬细胞和泡沫细胞。(2)与单核细胞比,巨噬细胞、泡沫细胞以及泡沫细胞加IL-1的ACAT-1 mRNA表达均明显增高,尤以泡沫细胞加IL-1中增高明显;与泡沫细胞加IL-1比,泡沫细胞加IL-1/IL-1单克隆抗体的ACAT-1 mRNA表达下降。结论:(1)IL-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1 mRNA的表达有上调作用,IL-1单克隆抗体可以拮抗这种效应。(2)IL-1可上调ACAT-1 mRNA表达水平,可能是巨噬细胞脂质过负荷后A-CAT-1上调的始动因子之一。

鸭梨PbHCT3基因的克隆及表达分析

羟基肉桂酰CoA:莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(HCT)是植物绿原酸合成的关键酶之一.该研究以鸭梨为材料,采用同源基因克隆的方法,克隆出一个鸭梨的HCT基因,命名为PbHCT3.PbHCT3基因cDNA全长序列为1 731bp,基因编码序列长度为1 317bp,编码438个氨基酸,含有酰基转移酶的2个保守序列HHAAD和DFGWG及保守结构域MVVNVTVRES.实时荧光定量PCR分析表明:PbHCT3基因在幼果果皮、果肉、果心、幼叶及花蕾期花瓣中的表达量较高.随着鸭梨果实生长,果实中PbHCT3基因表达量逐渐降低.研究表明,PbHCT3基因与鸭梨幼嫩组织的生长发育有密切关系.

ACAT-1在单核细胞向泡沫细胞分化过程中的表达变化

目的研究单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中脂酰CoA胆固醇酯酰转移酶-1(ACAT-1)表达及活性的变化。方法复苏、培养人单核细胞株THP-1细胞,与乙酸肉豆蔻佛波酯(PMA)、PMA+氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)共孵育1～4 d,RT-PCR方法检测单核细胞分化过程中ACAT-1 mRNA表达,Westernblotting检测ACAT-1蛋白表达的变化。结果(1)单核细胞复苏后加入PMA诱导48 h后,分化为巨噬细胞。经PMA+ox-LDL诱导24 h后分化为泡沫细胞。(2)与无血清培养单核细胞对照组比较,在PMA诱导单核细胞株THP-1向巨噬细胞分化过程中,ACAT-1 mRNA、蛋白表达及酶活性水平明显增高(P<0.05),呈时间依赖效应。(3)巨噬细胞向泡沫细胞分化过程中,ACAT-1 mRNA、蛋白表达及酶活性水平增高,呈时间依赖效应。但和无血清培养巨噬细胞比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论单核细胞株THP-1经PMA,PMA/ox-LDL诱导后,可分化为巨噬细胞、泡沫细胞。ACAT-1的表达及活性增高在单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中起着重要作用。

以葡萄糖为底物合成2-吡咯烷酮重组谷氨酸棒杆菌的构建及发酵研究

2-吡咯烷酮(2-pyrrolidone)因在纺织和制药行业的广泛应用而受到越来越多的关注。通过对合成2-吡咯烷酮途径的关键酶CoA转移酶的挖掘及功能的研究,首次探索了从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中建立2-吡咯烷酮合成途径,为未来可持续合成2-吡咯烷酮工业指明了方向。首先通过敲除N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)阻断L-精氨酸合成途径,促使更多葡萄糖流向L-谷氨酸。其次,通过表达将L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的谷氨酸脱羧酶(Gad)突变体,获得合成GABA的重组菌。同时,异源表达经N-端RBS优化的丙酸厌氧菌(Anaerotignum propionicum)来源的CoA转移酶,实现了GABA向2-吡咯烷酮的转化。最终,构建的C.glutamicum EAGAN2重组菌株在5 L发酵罐补料分批发酵72 h时,积累了(8±0.3)g/L的2-吡咯烷酮。该研究首次在谷氨酸棒杆菌中建立了2-吡咯烷酮合成途径,实现了以廉价原料葡萄糖为底物一步法合成2-吡咯烷酮。

三疣梭子蟹AACT基因克隆及其在卵巢发育中的表达分析

乙酰Co A酰基转移酶(acetyl-Co A C-acetyltransferase,AACT)是甲羟戊酸途径的初始酶,为了研究该酶在甲壳动物卵巢发育调控中的作用,用RT-PCR和c DNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆得到三疣梭子蟹AACT(Pt-AACT)的c DNA全长(Gen Bank登录号:KM033231)。这段序列全长1 630 bp,包括1个101 bp的5'端非编码区,1个395 bp的3'端非编码区和1个1 134 bp的开放阅读框,编码377个氨基酸。对其氨基酸序列进行生物信息学预测,发现Pt-AACT属于疏水性蛋白,无跨膜结构域,存在2个硫解酶特异性保守区。与其他已公布物种的AACT氨基酸序列进行比对,发现与金小蜂、埃及伊蚊等同源性最高(均为72%)。系统进化树结果显示,Pt-AACT与昆虫AACT聚为一支,用实时荧光定量PCR(qRTPCR)技术,分析三疣梭子蟹AACT的组织表达差异及在卵巢发育中的表达变化,结果表明AACT在大颚器中表达量最高,在其余组织中表达量较低,差异显著;在卵巢发育Ⅰ期表达量最高,与其他期存在极显著差异。表明AACT可能在三疣梭子蟹卵巢发育中具有一定调控作用。

Co^(2+)对红霉素生物合成过程的影响

研究了红霉素生物合成过程中糖代谢相关的关键酶:己糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、磷酸果糖激酶和异柠檬酸脱氢酶,以及合成红霉内酯环前体甲基丙二酰CoA相关的酶:甲基丙二酰CoA异构酶和甲基丙二酰CoA羧基转移酶的时序变化,并测定了过程中有机酸的含量变化。实验表明:Co2+能大幅提高红霉素效价。这可能与Co2+能明显提高甲基丙二酰CoA异构酶与甲基丙二酰CoA羧基转移酶的比活,并在一定程度上促进糖代谢有关。