化学镀CoWP薄膜的制备及磁性研究

利用化学镀的方法制备了CoWP磁性薄膜。研究了施镀时间对化学镀CoWP薄膜矫顽力和饱和磁化强度的影响，并利用场发射扫描电子显微镜（FSEM）、X射线衍射（XRD）和振动样品磁强计（VSM）研究了CoWP磁性薄膜的表面形貌、成分、微结构及磁学性能。结果表明，化学镀CoWP薄膜主要为hop结构co相，晶粒大小为2～3μm；随着施镀时间的增加，CoWP薄膜的饱和磁化强度也随之增大，最高达到122emu／g；CoWP薄膜的矫顽力都在250Oe以下。通过计算Kelly-Hankel（δM）曲线，证实了CoWP磁性薄膜中存在交换耦合作用，产生了剩磁增强效应。

安氏隐孢子虫COWP部分编码基因的表达及免疫原性

依据NCBI中安氏隐孢子虫囊壁蛋白(COWP)编码基因设计特异性引物,提取安氏隐孢子虫长春株总RNA,RT-PCR扩增目的基因AF,构建重组原核表达载体pET28a-AF,通过大肠杆菌BL21诱导表达,产物经SDS-PAGE以及Western blotting鉴定。然后纯化重组蛋白,通过免疫BALB/c小鼠进行体液免疫和细胞免疫水平的检测。结果显示,重组原核表达质粒pET28a-AF构建成功,Western blotting显示重组蛋白约为18 000,可被安氏隐孢子虫免疫小鼠的多克隆抗体和HRP标记的抗组氨酸抗体识别。重组蛋白免疫BALB/c小鼠的抗体水平差异显著(P<0.05),与对照组相比,CD4+的值差异极显著(P<0.01),而CD8+的值差异显著(P<0.05)。结果表明,成功克隆并表达了重组安氏隐孢子虫囊壁蛋白,纯化的重组蛋白具有一定的免疫原性。

隐孢子虫重组蛋白包被抗原的筛选及ELISA方法的建立及初步应用

为建立检测牛隐孢子虫抗体的间接ELISA方法,本研究将重组表达的隐孢子虫卵囊壁蛋白（COWP）、热休克蛋白70（HSP70）蛋白及COWP-HSP70串联蛋白分别作为包被抗原,进行反应条件的优化,建立了3种间接ELISA检测方法。建立的这3种方法均具有较高的特异性和敏感性。与伊氏锥虫,球虫和弓形虫阳性血清均无交叉反应,最低检出血清稀释倍数分别为1∶1 600、1∶3 200和1∶3 200。经过筛选,确定COWP-HSP70串联蛋白为包被抗原的间接ELISA方法为最佳检测方法。以该方法进行的重复性试验结果显示,其批内和批间变异系数分别为3.9%～8.2%和4.7%～8.3%。采用建立的ELISA方法与传统的粪检法分别对174份临床样品进行检测,隐孢子虫感染的检出率分别为9.2%和12.07%,两者符合率为97.13%。本研究建立的以COWPHSP70串联蛋白为包被抗原的牛隐孢子虫间接ELISA检测方法适用于临床牛隐孢子虫感染的检测。

安氏隐孢子虫卵囊壁蛋白的原核表达及其免疫原性研究

【目的】验证安氏隐孢子虫卵囊壁蛋白(COWP)的免疫原性,为建立安氏隐孢子虫病免疫学诊断方法奠定基础。【方法】根据Gen Bank已公布的安氏隐孢子虫COWP同源基因序列(DQ060431)设计引物,克隆COWP基因并构建原核表达载体,经IPTG诱导表达后,采用蛋白印迹法检测其免疫原性。【结果】扩增获得的COWP基因片段为549bp,其序列与Gen Bank已公布COWP同源基因序列(DQ060431)的同源性达100%,将其插入p ET-32a载体可构建p ET-32a-COWP表达载体。重组菌在30℃下经0.5 mmol/L IPTG诱导5 h后,其表达形式以可溶性表达为主;NTA-Ni亲和层析柱层析时用200 mmol/L咪唑洗脱液洗脱,即能得到纯化的重组蛋白,重组蛋白分子量约40 k Da。以抗His标签鼠单克隆抗体或鼠抗安氏隐孢子虫高免血清为一抗进行Western blotting检测,均能获得预期的目的条带。【结论】重组COWP蛋白具有良好的免疫原性,可作为安氏隐孢子虫病免疫学诊断的候选抗原。

奶牛安氏隐孢子虫巢氏PCR检测方法的建立及应用

为了建立敏感、稳定、重复性好的奶牛安氏隐孢子虫的巢氏PCR检测方法,本试验根据GenBank中安氏隐孢子虫18S rRNA和囊壁蛋白(COWP)基因序列设计2对引物,并通过程序优化建立了安氏隐孢子虫巢氏PCR检测方法。结果显示,18S rRNA和COWP巢氏PCR分别扩增出407 bp和430 bp的安氏隐孢子虫特异性基因片段,与预期相符,且扩增出的基因片段与已知基因序列(KX926454)同源性为100%;将阳性样本倍比稀释后进行18S rRNA和COWP巢氏PCR,最低检测量分别为24.3 pg/μL和243 pg/μL,扩增结果与目的片段大小一致,重复性良好,与大肠埃希菌、牛艾美尔球虫、弓形虫均无交叉反应;从华中地区采集的563份样品中,18S rRNA巢氏PCR检测出安氏隐孢子虫阳性185份,而COWP巢氏PCR仅检测出其中的148份;基于18S rRNA巢氏PCR,安氏隐孢子虫阳性率在秋季最高(36.71%),在冬季最低(16.25%),具有显著的统计学差异(P<0.01)。因此,本试验所建立的18S rRNA巢氏PCR和COWP巢氏PCR可为奶牛场安氏隐孢子虫的检测和防控提供有力的技术支持。

安氏隐孢子虫卵囊壁蛋白基因与热休克蛋白70基因的重组联合表达

利用双酶切方法将安氏隐孢子虫热休克蛋白70(HSP70)基因部分编码区连接到含有安氏隐孢子虫卵囊壁蛋白基因(COWP)的表达质粒pET-32a-COWP上,构建了表达质粒pET-32a-COWP-HSP70。将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,30℃,经1.5mmol/L IPTG诱导表达6h,表达产物主要以可溶的形式表达。使用小鼠抗安氏隐孢子虫超免疫血清为第一抗体进行Western-blot检测,结果有明显的目的条带出现,说明重组蛋白能被抗安氏隐孢子虫抗体识别。