短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制β-catenin表达的CPCs的构建

目的构建干扰大鼠耳蜗前体细胞（CPCs）β-catenin基因的短发夹RNA（shRNA）重组慢病毒载体，并对构建的载体进行鉴定。方法用聚合酶链式反应（PCR）方法扩增β-catenin基因，根据β-catenin基因设计shRNA oligo构建干扰载体，利用Gateway技术构建携带β-catenin基因的shRNA慢病毒载体，将构建好的慢病毒载体与辅助质粒pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5共转染293FT细胞，收集病毒上清获得病毒颗粒，经浓缩后用4种不同浓度（0.0、5.0、10.0、20.0 μl）的重组慢病毒瞬时感染大鼠CPCs，同时构建shRNA对照组，采用实时荧光PCR定量检测（qPCR）和免疫印迹法（Western blot）从基因和蛋白水平鉴定shRNA-β-catenin慢病毒载体对β-catenin的抑制效应。结果成功构建shRNA-β-catenin重组慢病毒载体，shβ-catenin和shβ-catenin-对照的病毒滴度分别为5.05×107和4.34×107。体外实验显示，4种不同浓度重组慢病毒转染的CPCs中的β-catenin蛋白量随着转染病毒浓度的增加而减少，各组间差异有统计学意义（P〈0.05），转染shβ-catenin的CPCs表达的β-catenin mRNA的量明显低于shβ-catenin-对照组，两组间差异有统计学意义（P〈0.05）。结论本次包装的β-catenin重组慢病毒载体具有较高的感染效力，慢病毒载体的成功构建为研究β-catenin在CPCs向听觉毛细胞的分化机制提供了一定的技术支持。