大肠杆菌非偏爱密码子的数量及位置对外源蛋白表达的影响

目的:研究大肠杆菌非偏爱密码子GGG在目的蛋白中的数量及位置对原核表达体系的影响。方法:以内皮抑素为研究对象,利用Overlapping-PCR定点突变内皮抑素中部密码子为GGG,构建到载体pET28a中,研究内皮抑素表达水平。结果:一个GGG密码子存在并不会降低或者阻止内皮抑素的表达,两个GGG存在并且距离很近时可显著降低内皮抑素的表达,当3个GGG串联存在时可阻止内皮抑素的表达。结论:GGG数量以及位置的不同可对外源目的蛋白的表达水平造成显著影响。

β_2肾上腺素受体基因的改造及在无细胞合成体系中的表达

依据大肠杆菌密码子偏好性,设计合成β_2肾上腺素受体(β_2 adrenergic receptor,β_2AR)基因序列,应用大肠杆菌无细胞系统对其进行高效表达,经负载镍离子的顺磁颗粒Magne His?Ni-Particles纯化后,对受体蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和活性鉴定。结果表明:改造后的β_2AR基因密码子适应指数(codon adaptation index,CAI)为0.96,GC含量从58%降低到46.17%,更有利于该基因在大肠杆菌系统中的表达。表达体系中优化后的Mg^(2+)浓度为22 mmol/L,此时表达量为1 250μg/mL。SDS-PAGE分析显示,纯化蛋白在47 k Da左右出现清晰的特异性条带,与预期结果一致,纯度大于90%。直接酶受体分析检测结果显示,当纯化受体蛋白1∶500稀释包被时,该重组受体与盐酸克伦特罗、沙丁胺醇及莱克多巴胺的酶标记物结合的OD值分别为0.976、0.836和0.728,亲和活性依次降低。β_2AR蛋白在无细胞体系中的成功表达,为研发基于受体的β激动剂多残留快速检测技术提供了理论支持。