Cofilin 1在肿瘤中的表达及意义

Cofilin 1(丝切蛋白1)是肌动蛋白相关蛋白,对肌动蛋白介导的细胞运动和骨架的改变起重要的调节作用。近年研究发现Cofilin 1的活化与肿瘤细胞的恶性侵袭性质有关。Cofilin 1的局部激活可以诱导片状伪足的形成,并影响肿瘤细胞运动的方向,从而增强肿瘤细胞的运动和迁移。最新研究成果显示,抑制或者增强Cofilin 1的活性可以减少肿瘤细胞的侵袭和迁移。Cofilin 1和p-Cofilin1在肿瘤细胞中的表达存在一个动态平衡,打破这个平衡可以直接抑制细胞的迁移和侵袭。本文对Cofilin 1的结构、功能、调控机制及平衡机制与肿瘤侵袭转移和上皮间质转化(EMT)以及肿瘤耐药性的关系作一综述。

miR-17-5p调控LIMK1/cofilin1通路对子宫内膜异位症发生发展的影响

目的:探究微小核糖核酸-17-5p(miR-17-5p)调控LIM激酶1(LIMK1)/丝切蛋白1(cofilin1)通路对子宫内膜异位症发生发展的影响。方法:选取行子宫切除术的30例子宫内膜异位症患者作为子宫内膜异位症在位内膜组,另选取30例非雌激素依赖性疾病患者作为正常子宫内膜组。对两组患者的在位内膜细胞中LIMK1、cofilin1表达量采用实时荧光定量PCR法检测,对所获取的在位内膜细胞进行转染,Transwell法检测细胞的侵袭能力;CCK-8法检测细胞的增殖能力;ELISA法检测子宫内膜细胞中细胞因子ICAM-1、VEGF、MMP-9表达。结果:在位内膜组患者的miR-17-5p表达水平低于正常子宫内膜组(P<0.05);在位内膜组的LIMK1蛋白及其mRNA、cofilin1蛋白及其mRNA相对表达水平均高于正常子宫内膜组(P<0.05);在位内膜组未转染组(EC组)及转染阴性对照(EC-C组)情况下细胞侵袭能力显著高于正常子宫内膜组(NC组),但转染情况下(EC-miR-17-5p-RNAi组)细胞侵袭能力显著低于正常子宫内膜组(NC-miR-17-5p-cDNA组),两组患者细胞转染阴性对照(EC-C组、NC-C组)与未转染状态(EC组、NC组)差异无统计学意义(P>0.05);转染情况在位内膜组患者(EC-miR-17-5p-RNAi组)细胞侵袭力低于未转染状态(EC组),但正常子宫内膜组(NC-miR-17-5p-cDNA组)高于未转染组(NC组,P>0.05)。EC组细胞增殖能力在24 h、48 h、72 h、96 h均高于NC组细胞(P<0.05);EC-miR-17-5p-RNAi组各时间段细胞增殖能力与EC组相比较均升高(P<0.05);EC组与EC-C组在各时间段的细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05);NC-miR-17-5p-cDNA组在各时间段的增殖能力均低于NC组(P<0.05);NC-C组各时间段的细胞增殖能力与NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。基础状态下,EC组ICAM-1、MMP-9和VEGF水平高于NC组,EC-miR-17-5p-RNAi组与EC组比较明显升高(P<0.05);EC组与EC-C组各指标比较差异无统计学意义(P>0.05);NC组ICAM-1、MMP-9和VEGF水平明显高于NC-miR-17-5p-cDNA组(P<0.05),但与NC-C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:miR-17-5p在内异症细胞中表达水平下调,通过负向调控LIMK1/cofilin1通路抑制细胞增殖、侵袭,在内异症发生及进展过程中发挥基因调节功能。

cofilin1在胃癌组织中表达的临床病理意义

目的检测胃癌组织中cofilin1蛋白的表达水平,探讨cofilin1蛋白在胃癌发生、发展中的作用。方法应用组织芯片与免疫组织化学SP法检测cofilin1在正常胃黏膜、上皮内瘤变和胃癌组织中的表达。结果 cofilin1在正常组织、上皮内瘤变与胃癌中表达呈递增趋势(P<0.05);弥漫型胃癌cofilin1阳性率显著高于肠型胃癌(P<0.05)。胃癌中瘤直径≤3.0cm的cofilin1的表达明显低于>3.0cm的表达(P<0.05)。淋巴结转移组表达明显高于未转移组(P<0.05)。TNM分期Ⅲ、Ⅳ期表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05)。cofilin1表达与患者性别差异无统计学意义(P>0.05)。结论 cofilin1与胃癌肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、临床分期密切相关,且与胃癌进展及预后密切相关,可能是胃癌侵袭转移的重要生物标志。

缺氧缺血脑损伤大鼠脑组织Cofilin 1与ERK1/2蛋白表达与磷酸化的分析

目的探索新生大鼠缺氧缺血脑损伤模型脑组织Cofilin1与ERK1/2蛋白表达与磷酸化及其在脑组织中分布的规律。方法新生7日龄SD大鼠,手术结扎左侧颈总动脉并经低氧处理造成缺氧缺血脑损伤(HIBD)模型,以假手术组为对照,应用western Blot和免疫组化方法检测损伤后一定时间段(0h～48h)损伤侧脑组织Cofilin1与磷酸化cofilin1(p-Cofilin1)及Erk1/2和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的表达变化,同时检测其在损伤大鼠脑组织和细胞中的表达和分布。结果 Western blot检测显示,HIBD新生SD大鼠脑组织中Cofilin1在HI后的表达与对照组相比也未见明显改变,但磷酸化Cofilin1在HI后1h～12h之间降低,24h后恢复正常;ERK1/2蛋白在不同时点的表达与对照组相比未见明显差异,但可见磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)在缺氧缺血处理(HI)后0h略低于正常,而在1-2h内迅速升高并高于正常对照和假手术,在2h后又逐渐降低。免疫组化结果显示Cofilin1与p-cofilin1在损伤大鼠脑中主要分布于海马和大脑皮质,尤其p-Cofilin表达分布以海马的颗粒细胞为主,并且在HI后7d-14d表达明显增强,在21d则明显降低。结论 Cofilin和ERK的磷酸化修饰与缺氧缺血脑损伤的发生和发展过程有较密切的关系,且cofilin1和p-cofilin1在大脑海马区的定位分布,提示其可能与大脑的学习记忆功能的损伤与修复有一定的关系。

结肠癌组织中Cofilin-1蛋白的表达及临床病理意义

目的探讨结肠癌组织中Cofilin-1蛋白的表达及其与肿瘤侵袭和转移的关系。方法应用免疫组织化学SP法检测60例结肠癌组织、40例癌旁正常组织、26例转移淋巴结组织标本中Cofilin-1蛋白的表达水平,并结合临床病理参数进行分析。结果 Cofilin-1蛋白在结肠癌组织、转移淋巴结组织中表达率分别为76.7%、61.5%,均明显高于癌旁正常组织中的32.5%表达率。Cofilin-1在结肠癌组织、转移淋巴结组织中的表达率明显高于癌旁正常组织,差异均有统计学意义(P<0.05);Cofilin-1蛋白的表达水平与结肠癌组织分化程度、Dukes分期、浆膜侵犯及淋巴结转移有关(P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤大小无明显相关(P>0.05);Cofilin-1与结肠癌预后密切相关(P<0.05)。结论检测Cofilin-1蛋白的表达有助于判断结肠癌的浸润、转移及预后。

DADS通过Rac1-ADF/cofilin1通路抑制人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭

目的:研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)通过Rac1-ADF/cofilin1通路对人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭的作用。方法:划痕愈合和侵袭实验分别检测DADS对SW480细胞迁移与侵袭的影响;RT-PCR与Western blot检测DADS对SW480细胞Rac1-ADF/cofilin1信号分子表达的作用。结果:40与50 mg/L DADS处理SW480细胞24 h后,穿膜细胞分别减少57.12%与64.59%(P<0.05)。处理48 h细胞迁移率分别为23.23%与12.87%,较对照组75.86%明显降低(P<0.05)。RT-PCR显示,45 mg/LDADS处理SW480细胞24、48 h后,与对照组比较Rac1、Rock1、PAK1、LIMK1和destrin mRNA分别显著下调(P<0.01);而cofilin1mRNA无显著性差异(P>0.05)。Western blot显示,45 mg/L DADS处理SW480细胞6、12、24、48 h后,与对照组比较Rac1、Rock1、PAK1、LIMK1和destrin蛋白分别呈时间依赖性下调(P<0.05),但cofilin1蛋白无显著性差异(P>0.05),而p-LIMK1和p-cofilin1表达分别呈时间依赖性下调(P<0.05)。结论:DADS可通过Rac1-ADF/cofilin1通路下调Rac1、Rock1、PAK1、LIMK1、p-LIMK1、destrin与p-cofilin1抑制SW480细胞迁移与侵袭。

LIMK-1/cofilin在姜黄素抑制人肺癌细胞增殖和转移中的作用

目的探讨姜黄素对人肺癌细胞株(801D)增殖和转移的影响,并通过检测姜黄素对细胞内LIMK-1/cofilin蛋白表达及细胞骨架重组的影响,揭示LIMK-1/cofilin在姜黄素抑制肺癌转移中的作用。方法应用MTT法检测姜黄素对人肺癌细胞株增殖能力的影响,体外侵袭实验和迁移实验观察姜黄素对肺癌细胞转移能力的影响。Western blot法检测姜黄素对与细胞骨架重组相关的LIMK-1/cofilin及磷酸化LIMK-1/cofilin蛋白表达的影响。激光共聚焦扫描显微镜观察姜黄素对细胞骨架重组的影响。结果姜黄素能够抑制人肺癌细胞801D增殖,抑制率均随处理浓度增大和作用时间延长而增加。与对照组比较,10μmol/L、20μmol/L的姜黄素处理24小时后的801D细胞体外侵袭和迁移能力均显著下降(P<0.01)。姜黄素能显著下调LIMK-1/cofilin蛋白的磷酸化水平(P<0.05),并能影响细胞内微丝骨架的结构和分布。结论姜黄素抑制肺癌细胞体外增殖和转移能力与姜黄素调控LIMK-1/cofilin信号通路与肺癌细胞微丝骨架结构有关。

LIMK1过表达通过LIMK1/cofilin1通路促进人胃癌MGC803细胞增殖与迁移侵袭

目的:探讨LIMK1过表达对人胃癌MGC803细胞增殖与迁移侵袭的影响。方法:真核表达载体转染技术构建过表达LIMK1基因MGC803细胞;RT-PCR和Western blot检测LIMK1、Cofilin1、p-Cofilin1表达;MTT、流式细胞术、细胞划痕和侵袭实验分别检测LIMK1过表达对MGC803细胞增殖、细胞周期、迁移与侵袭能力的影响。结果:成功构建稳定过表达LIMK1基因MGC803细胞。MTT显示,LIMK1过表达组细胞的增殖活性呈时间依赖性,高于对照组和空载体组(P<0.001)。流式细胞术检测显示,LIMK1过表达组G2/M期细胞百分率8.36%,较MGC803组11.45%(P=0.0054)和空载体组11.59%降低(P=0.0056)。划痕实验显示,24 h后LIMK1过表达组迁移距离(163.9±1.5)mm分别高于MGC803组(127.1±2.0)mm(P<0.0001)和空载体组(124.1±3.1)mm(P<0.0001)。侵袭实验显示,LIMK1过表达组穿膜细胞(86.3±4.2)个分别明显多于MGC803组(48.3±2.5)个(P=0.0003)和空载体组(49.3±3.1)个(P=0.0003)。RT-PCR和Western blot显示,LIMK1过表达组LIMK1表达分别高于对照组(P<0.0001)和空载体组(P=0.0002),p-LIMK1表达分别高于对照组(P=0.0003)和空载体组(P=0.0004)。LIMK1过表达组Cofilin1 mRNA与蛋白表达较MGC803组和空载体组差异均无统计学意义(P>0.05),而p-Cofilin1表达分别高于对照组(P=0.0009)和空载体组(P=0.0018)。结论:LIMK1过表达可通过激活LIMK1/cofilin1通路促进MGC803细胞增殖与迁移侵袭。

DADS通过Rac1/LIMK1/cofilin1通路增强沉默LIMK1抑制人胃癌BGC823细胞迁移侵袭

探讨二烯丙基二硫(DADS)通过Rac1/LIMK1/cofilin1通路对沉默LIMK1抑制BGC823细胞迁移侵袭的影响。划痕实验和侵袭实验观察迁移和侵袭能力;RT-PCR、Western blot、免疫组化检测LIMK1、Rac1、Rock1、Pak1与Cofilin1和p-Cofilin1表达。结果显示,DADS处理沉默组疤痕距离较对照组和沉默组增加(P<0.05)。DADS处理沉默组穿膜细胞低于对照组、空载体组与沉默组(P<0.05)。沉默组LIMK1表达低于对照组和空载体组,DADS后,各处理组低于处理前各组(P<0.05)。并且,沉默组、对照组和空载体组的Rac1、Rock1、Pak1与p-cofilin1表达下调(P<0.05)。表明DADS可增强沉默LIMK1抑制BGC823细胞迁移侵袭,机制可能与阻断Rac1/LIMK1/cofilin1通路有关。

结肠癌组织中Cofilin-1、Ezrin蛋白的表达及临床病理意义

目的探讨结肠癌组织中Cofilin-1蛋白和Ezrin蛋白的表达及其与肿瘤侵袭和转移的关系。方法以40例癌旁正常组织作为对照,应用免疫组织化学SP法检测60例结肠癌组织标本中Cofilin-1蛋白和Ezrin蛋白的表达。结果 60例结肠癌组织中Cofilin-1阳性表达率为76.7%,Ezrin阳性表达率为80.0%。Cofilin-1和Ezrin蛋白的表达情况与临床分期、淋巴结转移及Dukes分期有关(P<0.05)。结肠癌组织中Cofilin-1与Ezrin表达呈正相关(P<0.05)。结论联合检测Cofilin-1蛋白和Ezrin蛋白的表达有助于综合判断结肠癌的浸润、转移及预后。

熊果酸对胃癌细胞中cofilin-1蛋白表达的影响

目的研究熊果酸作用胃癌细胞BGC-823后丝切蛋白cofilin-1表达的变化。方法熊果酸作用于细胞BGC-823,双向电泳结合质谱检测胞质内cofilin-1的表达,免疫印迹检测cofilin-1蛋白和细胞色素C的表达。结果胞质内cofilin-1蛋白表达降低(P<0.01),而线粒体表达却明显升高(P<0.01),同时细胞色素C在胞质中的表达量也明显下调(P<0.01)。结论熊果酸作用BGC-823,可能使cofilin-1蛋白从胞质转位至线粒体内,促使细胞色素C释放,激活caspase级联反应,诱导细胞凋亡。

大黄酸调控Rac1/LIMK1/cofilin信号通路抑制卵巢癌细胞运动与侵袭

目的探讨大黄酸对卵巢癌淋巴结高转移SKOV3-PM4细胞运动和侵袭能力的影响,揭示大黄酸调控Rac1/LIMK1/cofilin信号通路与抑制卵巢癌细胞运动侵袭作用的机制。方法划痕实验观察大黄酸对卵巢癌细胞运动的影响,Matrigel-Transwell方法检测细胞侵袭能力,激光共聚焦扫描显微镜和扫描电镜观察大黄酸对卵巢癌细胞形态和细胞骨架超微结构的影响,Western blot分别检测Rac1/LIMK1/cofilin通路上Rac1、LIMK1、PAK1、cofilin蛋白的表达。结果与空白对照组相比,大黄酸能抑制SKOV3-PM4细胞侵袭和迁移能力,浓度为8.8、17.60、26.40μmol·L^(-1)的大黄酸处理24 h后,细胞体外迁移和侵袭能力均明显下降(P<0.05);细胞出现伪足减少,细胞内微丝断裂、分布紊乱,质膜凹凸不平、细胞间的间隙变宽等超微结构改变;Western blot结果表明大黄酸能明显下调Rac1蛋白的表达水平,并呈浓度依赖性。卵巢癌细胞经大黄酸及Rac1抑制剂处理后,磷酸化LIMK1、cofilin、PAK1蛋白水平与空白对照组比较明显下降,且大黄酸联合Rac1抑制剂处理后的磷酸化蛋白下调更为明显(P<0.05);而Rac1激活剂联合大黄酸组比大黄酸组磷酸化蛋白上调明显(P<0.05)。结论大黄酸为潜在的Rac1小分子抑制剂,其作用机制可能是调控Rac1/LIMK1/cofilin信号通路,抑制卵巢癌淋巴结转移细胞运动和侵袭的能力。

PDGF调控子宫内膜异位症在位内膜间质细胞中cofilin-1基因的表达及意义

目的:探讨cofilin-1基因(CFL1)在子宫内膜异位症在位内膜间质细胞(ESC)异常表达与血小板源性生长因子(PDGF)的关系。方法:获取在位子宫内膜组织,分离培养ESC,以不同的时间和不同浓度的PDGF作用ESC,实时定量PCR检测在PDGF刺激前后CFL1的表达。结果:10 ng.ml-1PDGF作用3、6、12 h,CFL1 mRNA表达均增高,其中作用6 h和12 h表达增高有统计学意义(P<0.05);以1、10、100 ng.ml-1的PDGF分别作用ESC 6 h,CFL1 mRNA表达均增高,有统计学意义(P<0.05)。CFL1在ESC中的表达对PDGF有时间依赖性和剂量依赖性。结论:PDGF是子宫内膜异位症在位内膜间质细胞CFL1表达的强诱导剂。

Cofilin1及其Ser3位点磷酸化与老年非小细胞肺癌患者放疗敏感性的相关性研究

目的探讨Cofilin1及其Ser3位点磷酸化水平与老年非小细胞肺癌(NSCLC)患者放疗敏感性的相关性。方法选取2013年6月—2015年4月于我院行手术切除、经病理确诊并接受术后放疗的老年NSCLC患者102例,根据疗效分为放疗敏感组(55例)和放疗抵抗组(47例),检测Cofilin1及其Ser3位点磷酸化蛋白Cofilin1(phos‐pho S3)的表达,并记录患者的生存时间和生存率。结果放疗抵抗组Cofilin1阳性表达组织的TNM分期和淋巴结转移率均显著升高,而Cofilin1(phospho S3)阳性表达组织显著降低(P<0.05)。放疗抵抗组的Cofilin1阳性表达率显著高于放疗敏感组,而放疗敏感组的Cofilin1(phospho S3)阳性表达率显著高于放疗抵抗组(P<0.05)。淋巴结转移、Cofilin1高表达、Cofilin1(phospho S3)低表达是放疗抵抗的独立预测因素(P<0.05)。放疗敏感组、Cofilin1阴性患者、Cofilin1(phospho S3)阳性患者的无进展生存时间(PFS)较长、5年生存率较高(P<0.05);放疗敏感组中,Cofilin1阴性和Cofilin1(phospho S3)阳性患者PFS最长、5年生存率最高(P<0.05);放疗抵抗组中,Cofilin1阳性和Cofilin1(phospho S3)阴性患者PFS最短、5年生存率最低(P<0.05)。结论老年NSCLC患者的放疗敏感性与Co‐filin1表达呈明显负相关,与Cofilin1的Ser3位点磷酸化水平呈显著正相关。Cofilin1及其Ser3位点磷酸化是放疗敏感性的独立预测因素,对老年NSCLC患者的预后评估具有重要意义。

过表达Cofilin-1对人胶质瘤细胞侵袭和增殖及凋亡的影响

【目的】分析胶质瘤细胞系中丝切蛋白-1（Cofilin-1）的表达水平，探讨其对胶质瘤细胞增殖、凋亡及侵袭的作用及分子机制。【方法】采用基因克隆技术，构建Cofilin-1过表达质粒，转染人胶质瘤细胞系U-87MG细胞。Real-timePCR及Westernblot检测验证Cofilin-1转染效果；MTT实验检测细胞增殖能力；Transwell小室实验检测细胞侵袭能力；ELISA实验检测细胞培养上清中血管内皮生长因子A（VEGFA）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）含量；Westernblot检测细胞中凋亡相关蛋白bax和Bcl-2及AKT和p-AKT蛋白的表达水平。【结果】转染Cofilin-1过表达质粒后，U-87MG细胞中Cofilin-1的表达水平显著升高；Cofilin-1过表达促进sHG44细胞增殖和侵袭能力，细胞培养上清中VEGFA和MMP-9含量升高；细胞凋亡相关蛋白bax表达降低而Bcl-2表达升高，细胞胞中p．AKT蛋白的表达水平增加。【结论】Cofi1in-1过表达能够促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭，其机制可能通是过AKT通路活化发挥作用；Cofilin-1可能成为胶质瘤的潜在治疗靶点。

小鼠cofilin-1基因及其真核表达载体的构建与体内外表达

【目的】构建能够在神经系统中高效表达的小鼠cofilin-1野生型(Cfl1-wt)、活化型(Cfl1-S3A)、失活型(Cfl1-S3D)3种真核表达载体,并研究其在鸡胚脊髓神经元中的表达情况,为进一步探讨cofilin-1在大脑发育过程中对神经元迁移的影响奠定基础。【方法】从成年小鼠大脑组织中提取RNA,经反转录获得cDNA样本,RT-PCR扩增小鼠cofilin-1基因的CDS区,经引物设计引入点突变,扩增了野生型、活化型及失活型的cofilin-1基因片段,克隆入pCAG-MCS-myc真核表达载体中。经双酶切和测序鉴定后,转染CHO细胞,通过半定量RT-PCR和免疫荧光染色检测其在细胞中的表达情况。利用鸡胚活体原位电转的方法,将重组质粒转染胚胎发育第3天(E3)的鸡胚脊髓,在胚胎发育第6天(E6)取材,切片后经免疫荧光染色观察并统计分析重组质粒在脊髓中的表达情况。【结果】克隆并模拟了小鼠cofilin-1野生型、活化型和失活型的cDNA片段,成功构建了pCAG-cfl1-wt、pCAG-cfl1-S3A和pCAGcfl1-S3D3种真核表达载体。体外转染CHO细胞,半定量RT-PCR检测及统计学分析表明,转染重组质粒的CHO细胞中,Cofilin-1mRNA相对表达量与对照组(未转染质粒的正常CHO细胞)存在显著性差异;免疫荧光染色后观察到了Cofilin-1融合蛋白的表达。对经活体原位电转转染重组质粒的鸡胚脊髓切片进行免疫荧光染色,检测到Cofilin-1融合蛋白的表达,且重组质粒转染效果与pCAG-EGFP转染效果无明显差异。【结论】pCAG-cfl1-wt、pCAGcfl1-S3A和pCAG-cfl1-S3D3种真核表达载体的成功构建及其在体内外的高效表达,为进一步研究cofilin-1及其Ser3位点的磷酸化在神经元迁移中的作用机制奠定了基础。

高糖对ECV304细胞中Cofilin-1表达及PKC活性的影响

目的:探讨高糖刺激对ECV304细胞中Cofilin-1的表达及蛋白激酶C(PKC)活性的影响。方法:常规培养ECV304细胞,分组给药后,非放射性酶法检测该细胞中PKC的活性,RT-PCR法检测细胞Cofilin-1总mRNA的表达。结果:经高糖作用后,ECV304细胞PKC活性较低糖的正常组明显增加(P<0.01),细胞内Cofilin-1总mRNA的表达显著增强(P<0.01);而预先给予PKC抑制剂GF109203x处理能显著地抑制高糖介导的ECV304细胞内PKC活性的升高(P<0.01)和胞内Cofilin-1总mRNA的表达(P<0.05),但对正常组PKC活性和Cofilin-1总mRNA的表达无显著性影响。结论:高糖刺激可能通过PKC信号传导通路使Cofilin-1表达增强,进一步导致糖尿病血管病变的发生。

RNA干扰Cofilin-1基因沉默对人肝癌细胞株Huh-7侵袭和转移能力的影响

目的 Cofilin-1参与多种肿瘤的发病过程,但该基因在肝细胞肝癌中表达和作用不明确。文中拟观察Cofilin-1基因在人肝癌组织中的表达情况,探讨下调Cofilin-1表达对肝癌细胞株Huh-7侵袭和转移能力的影响。方法采用实时荧光定量PCR检测Cofilin-1基因在肝癌组织和癌旁组织中的表达情况;体外合成Cofilin-1序列特异性小干扰RNA,应用脂质体转染Huh-7肝癌细胞株,实验分Cofilin-1-siRNA组(Cofilin-1-siRNA转染Huh-7细胞)、非特异性-RNA组(Ctrl-siRNA组,非特异性siRNA转染Huh-7细胞)、未转染组(未转染Huh-7细胞),每组设2个平行孔。Western blot鉴定Cofilin-1蛋白水平变化。细胞迁移及体外侵袭实验观察转染后细胞的侵袭能力的影响。结果与癌旁组织相比,肝癌组织中Cofilin-1基因表达明显增强[(0.698±0.156)vs(3.523±0.412),P<0.05];Cofilin-1-siRNA组Cofilin-1的蛋白量为0.558±0.033,明显低于Ctrl-siRNA组(0.933±0.015)和未转染组(0.961±0.020),差异有统计学意义(P<0.05);体外细胞迁移和侵袭实验结果均显示:与Ctrl-siRNA组迁移及侵袭细胞数量[(79.00±1.33)个]和未转染组[(74.50±1.35)个]比较,Cofilin-1-siRNA组[(58.50±1.78)个]明显降低(P<0.05);Cofilin-1-siRNA组穿膜Huh-7细胞数[(36.50±0.83)个]明显低于Ctrl-siRNA组[(60.20±1.60)个]与未转染组[(51.50±1.14)个],差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Cofilin-1在肝癌组织中高表达,下调Cofilin-1基因的表达能抑制肝癌细胞株Hu H-7的侵袭和转移能力。

Cofilin-1与肝癌细胞迁移侵袭能力的相关性研究

探讨丝切蛋白1(Cofilin-1)与肝癌细胞的迁移、侵袭能力的关系,运用免疫印迹试验(western blot)检测肝癌细胞(Huh-7细胞)、转染上皮生长因子受体的人肝癌细胞(Huh-7-EGFR细胞)与转染上皮生长因子受体突变体Ⅲ的人肝癌细胞(Huh-7-EGFRvⅢ细胞)三种细胞中Cofilin-1的蛋白表达。然后将Cofilin-1用慢病毒表达系统导入Huh-7细胞,构建转染丝切蛋白1的人肝癌细胞(Huh-7-Cofilin-1细胞)系,并应用迁移侵袭实验检测细胞迁移侵袭的能力;再用RNA干扰(siRNA)技术沉默Huh-7-EGFRvⅢ细胞中的Cofilin-1,然后应用迁移侵袭实验检测细胞的迁移侵袭能力。结果显示:转染Cofilin-1后,Huh-7细胞的迁移侵袭能力显著增强(P<0.05);而干扰Cofilin-1后,Huh-7-EGFRvⅢ细胞迁移与侵袭能力明显减弱(P<0.05)。表明Cofilin-1参与肝癌细胞迁移与侵袭。

Cofilin-1慢病毒载体的构建及其在Huh-7中的过表达

目的构建Cofilin-1过表达的Huh-7细胞株。方法应用RT-PCR克隆出Cofilin-1的完整编码序列,将其亚克隆到慢病毒载体pWPT中,构建慢病毒载体表达质粒pWPT-Cofilin-1;将慢病毒表达质粒pWPT-Cofi-lin-1或pWPT-GFP与慢病毒包装质粒pMD2.G、psPAX2共转染293T细胞,获得携带Cofilin-1完整编码序列的慢病毒和携带GFP基因的慢病毒,将两种慢病毒分别感染Huh-7细胞;通过Real-TimePCR和Western blot检测Huh-7细胞中的Cofilin-1的过表达情况。结果测序结果显示成功构建重组慢病毒表达质粒pWPT-Cofilin-1;慢病毒有效感染Huh-7细胞,依据GFP绿色荧光可测定感染有效率超过95%;Cofilin-1在Huh-7细胞中的mRNA量和蛋白水平都成功的过表达。结论本实验的完成,为进一步研究Cofilin-1基因在肝癌中的生物功能和作用机制奠定了基础。