从Cohn法组份Ⅳ中分离纯化人血浆蛋白C

目的探索建立1种串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析从Cohn法组份Ⅳ分离纯化蛋白C的方法 ,降低纯化蛋白C的成本,并实现血浆的综合利用。方法 4℃条件下,将Cohn法组份Ⅳ用PBS缓冲液抽提5h,离心(6500g)40min,上清液依次用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤后,超滤透析;再通过串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析,对蛋白C进行纯化。通过SDS-PAGE鉴定蛋白C的纯度;用考马斯亮蓝法通过紫外分光光度计测定总蛋白含量;通过WHO指定的发色底物法和凝固法(一期法)测定蛋白C活性。结果纯化的蛋白C在SDS-PAGE图谱上呈现1条62kD左右的蛋白带;经过离子交换层析,蛋白C的活性回收率为(48.19±9.22)%,纯化倍数为(3.75±0.56)倍;固相化金属螯合亲和层析后,蛋白C活性回收率为(59.61±5.59)%,纯化倍数为(36.79±3.72)倍;蛋白C总活性回收率为(28.77±9.45)%,纯化倍数为(136.64±6.82)倍,比活性为(11.70±0.89)IU/mg。结论串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析可以从Cohn法组份Ⅳ中获得比活性较高的蛋白C浓缩物。

从Cohn氏组分Ⅳ沉淀中回收白蛋白的低温工艺

目的:探索低温环境下从Cohn氏组分Ⅳ沉淀中回收白蛋白的生产工艺条件。方法:在低温乙醇法的基础上进行改进,控制温度、乙醇浓度、酸碱度,提取组分Ⅳ沉淀中残留的白蛋白,选择合适的生产条件。结果:控制适当的工艺参数,回收的产品为浅黄绿色澄清液体,纯度>97%,吸收度<0.1,多聚体含量<5%,PKA<30IU/mL,仅与抗人的血清产生沉淀线,主要沉淀线为白蛋白;安全试验、无菌试验、热原质试验、热稳定性试验均符合要求。每千克组分Ⅳ沉淀回收的白蛋白在50g左右。结论:在低温环境下能有效地回收组分Ⅳ沉淀中的白蛋白,回收产品质量符合要求。

具有Holling Ⅳ型功能反应的分数阶捕食者-食饵模型的动力学分析

讨论了一类具有Holling Ⅳ型功能反应和Leslie-Gower数值反应的分数阶捕食者-食饵模型。利用分数阶微分系统的稳定性理论,给出了该系统在平衡点稳定的必要条件和充分条件。数值模拟也体现了分数阶微分系统的复杂性和丰富性。

从Cohn氏法组分Ⅲ沉淀纯化人凝血因子Ⅶ

目的探索从Cohn氏法组分Ⅲ(组分Ⅲ)沉淀中纯化人凝血因子Ⅶ(FⅦ)的方法并对纯化产物进行鉴定。方法将组分Ⅲ沉淀溶解,经柠檬酸钡吸附、洗脱、硫酸铵沉淀、2次DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤纯化人FⅦ。结果从400g组分Ⅲ沉淀中最终得到10.1mg纯化的FⅦ,活性为1775.8U/mg,FⅦ被浓缩了近6000倍,总活性回收率为17.6%,SDS-PAGE电泳鉴定只有1条主条带。结论组分Ⅲ沉淀中有很高FⅧ活性;建立了从组分Ⅲ沉淀中纯化人FⅦ的方法。

亲和凝胶分离纯化人α1-抗胰蛋白酶的研究

目的探索通过免疫亲和层析从Cohn法组份Ⅳ分离纯化人α1-抗胰蛋白酶浓缩物的方法。方法 24℃下,将Cohn氏法组份Ⅳ用Tris缓冲液抽提0.5 h后,离心4 750 g×15 min,上清液加入亲水型气相二氧化硅脱脂后,离心6 000 g×15 min,再用1.2μm的滤膜过滤;通过GE公司新型的Alpha-1 Antitrypsin Select免疫亲和凝胶层析柱,对α1-抗胰蛋白酶进行纯化。用考马斯亮蓝法通过紫外分光光度计测定总蛋白含量;用SDS-PAGE鉴定α1-抗胰蛋白酶的纯度,并用Western Blot和串联质谱分析鉴定纯化的蛋白;通过发色底物法测定α1-抗胰蛋白酶活性。结果纯化的α1-抗胰蛋白酶在非还原性SDS-PAGE图谱上呈现1条54 kD左右的蛋白带和1条约140 kD的多聚体蛋白带,经过还原性SDS-PAGE多聚体条带解聚,Western Blot也可以反应相关变化;在经过前处理和亲和层析后,α1-抗胰蛋白酶活性回收率为(60.35±1.39)%,α1-抗胰蛋白酶总活性回收率为(41.88±6.98)%,纯化倍数为(71.68±1.32)倍,比活性大约(1.00～1.05)PU/mg。结论 GE公司Alpha-1 Antitrypsin Select免疫亲和层析亲和层析可以从Cohn氏法组份Ⅳ中特异性捕获α1-抗胰蛋白酶浓缩物。

α_1-抗胰蛋白酶制剂的制备及其病毒灭活

目的 从Ｃｏｈｎ ＦⅣ中提纯α１－抗胰蛋白酶（α１－Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ α１－ＡＴ，制备较高纯度α１－ＡＴ制剂。方法 对Ｃｏｈｎ ＦⅣ抽提液经沉淀、超滤、离子交换及凝胶过滤，提纯 α１－ＡＴ用巴氏法（液态，６０℃，１０ｈ加热）作病毒灭活， 并考察其效果。用免疫单扩散、双向交叉免疫电泳、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及合成基质法检测α１－ＡＴ蛋白及生物活性。用区带 扫描法测定α１－ＡＴ制剂的纯度。结果３批试制的α１－ＡＴ制剂的纯度为９１．３±１．５２％，比活０．４９±０．０８μ／ｍｇ，比活性 比抽提液提高了２７．４倍。巴氏法处理可使ＶＳＶ、Ｓｉｎｄｂｉｓ、Ｐｏｌｉｏ Ｉ型疫苗病毒分别降低１０．０±０．３，１０．０±０．３１及７．１１ ±０．３ｌｇＴＣＩＤ５０／ｍｌ，但仍能检出Ｐｏｌｉｏ型疫苗病毒。结论 可从 Ｃｏｈｎ ＦⅣ中制得较高纯度的 α１－ＡＴ制剂，巴氏法能对 α１－ＡＴ制剂作有效的病毒灭活处理。

人血白蛋白热原去除工艺的实验

在热原不合格的白蛋白制品中，加入血浆蛋白Ｃｏｈｎ分部ＩＶ－１、ＩＶ－４组份进行热变性沉淀去除热原。经处理后，热原检测（兔法）表明，４批平均降温０．４７℃回收率为７２．５％，白蛋白５７％５０ｈ的热稳定性试验合格。其它常规检测项目均符合生物制品规程要求。

人血白蛋白的两种低温乙醇工艺的比较

以正常人新鲜冰冻血浆作原料，采用低温乙醇Ｃｏｈｎ５法相６法进行对照性中量试生产。结果表明，Ｃｏｈｎ６法所得白蛋白半制品的３批收率平均为２．４４±０．１ｇ／１００ｍｌ血浆，纯度平均为９８．６±０．６％，分别比Ｃｏｈｎ５法提高０．１２ｇ／１００ｍｌ血浆和１％；就分离白蛋白而言，Ｃｏｈｎ６法较Ｃｏｈｎ５法更为理想。

毛细管区带电泳用于血浆蛋白质混合物的分析

目的探索建立采用毛细管区带电泳(CZE)法分析血浆相关蛋白质的条件和方法。方法 1)以血浆COHN法组分Ⅳ(CFⅣ)抽提液为样品,代表蛋白质混合物,分别从波长、基本缓冲液、添加剂、PH、温度等方面,摸索CEZ分析蛋白质混合物的较优条件和方法;2)将摸索得到的较优条件下的CZE分析CFⅣ抽提液的结果,并与通过高效液相色谱(HPLC)法、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法及双向电泳(2-DE)法分析CFⅣ抽提液的结果比较;3)采用较优条件下的CZE法分析标准血浆、标准血浆经离子交换层析(IEC)的FⅧ粗提液等,考察该条件是否适用于血浆中的其他组分。结果 1)CZE法分析CFⅣ抽提液的较优条件为:20℃以214 nm紫外吸收波长,0.5 psi压力进样10 s,10 kV恒压分析50 min,缓冲体系为pH 9.0的0.04 mol/L硼酸硼砂、0.05%SDS、0.007 5%腐胺;2)采用此条件的CZE法分析CFⅣ得到14个蛋白峰、分析时间50 min,HPLC法分析得到10个蛋白峰、分析时间60 min,SDS-PAGE法分析得到11条蛋白条带、分析时间120 min,2-DE法分析得到14个蛋白点数(与CZE分析的蛋白峰数数量相同)、分析时间3 d;3)CZE法用于标准血浆、标准血浆经离子交换层析的FⅧ粗提液的分析可分别分辩出22和11个蛋白峰。结论以CZE法分析血浆相关蛋白混合物与现有分析方法比较,能达到较好的分析效果,经摸索确定的较优分析条件具有一定的通用性。

α_1-抗胰蛋白酶的分离纯化

为建立从Cohn′s组分IV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)的技术路线,以Cohn′s组分IV为原料,利用还原剂1,4-二硫苏糖醇(DTT)、气相二氧化硅等处理,再经压滤、离子交换层析和疏水层析提取α1-AT。用SDS-PAGE及合成基质法检测α1-AT的纯度以及生物活性。结果可见,Cohn组分IV沉淀中α1-AT占蛋白总量的11%～13%,经该工艺提取的α1-抗胰蛋白酶纯度为97.6%,疏水层析后α1-AT的收获率为21%,比活为每毫克总蛋白中含0.54mg功能活性α1-AT。可见用此方法从Cohn组分IV沉淀中可制备高纯度的α1-AT。

人血浆Cohn法组分Ⅳ沉淀的综合利用研究

目的采用全层析工艺从废弃的Cohn法组分Ⅳ沉淀(Cohn fraction Ⅳ precipitate, Cohn F Ⅳ)中提取抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ, AT Ⅲ)、α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)和人血白蛋白进行综合利用。方法将Cohn F Ⅳ溶解并澄清处理后进行SD法病毒灭活,得到上柱前料液,再依次采用阴离子交换层析、肝素亲和层析+α1-AT Select串联亲和层析、疏水层析以及分子筛层析后分别得到AT Ⅲ和α1-AT的纯品以及主要含有人血白蛋白的组分。对AT Ⅲ和α1-AT分别进行纯度、活性以及肝素亲和力等方面的检测,并评价其质量属性。结果采用此方法获得的AT Ⅲ纯度可达99%以上,比活达10 IU/mg以上,肝素亲和力达80%以上;α1-AT纯度同样可达99%以上,比活达1.5 PU/mg以上。结论本研究所述方法可成功将Cohn F Ⅳ中的AT Ⅲ、α1-AT以及人血白蛋白等几种目前最具备提取利用价值的蛋白进行有效的分离,在人血浆综合利用方面具有较高的利用价值。

低温乙醇法和硫酸铵盐析法制备的抗人T细胞猪免疫球蛋白与同类型兔源性制品体外活性的比对

目的比较低温乙醇法和硫酸铵盐析法制备的抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte porcine immunoglobulin,P-ATG)与市售的抗人胸腺细胞及抗人T细胞兔免疫球蛋白的体外活性,以评价两种工艺制备的P-ATG的性能。方法采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)法检测4种制品杀伤靶细胞的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)效应;CCK-8法检测4种制品杀伤靶细胞的补体依赖性细胞毒作用(complement dependent cytotoxicity,CDC)效应;细胞双重免疫荧光标记法检测4种制品与不同T细胞抗原(CD3、CD4、CD8)的共定位情况。结果4种制品中,仅抗人胸腺细胞兔免疫球蛋白在高浓度(1 mg/mL)下对人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)有较弱的ADCC效应;4种制品均可介导人PBMC产生CDC效应,且呈剂量依赖性,其中抗人胸腺细胞兔免疫球蛋白的活性较高,为两种工艺制备的P-ATG或抗人T细胞兔免疫球蛋白的3~4倍,抗人T细胞兔免疫球蛋白的活性与P-ATG相当;4种制品与T细胞表面抗原CD3、CD4的共定位细胞比例相近,抗人胸腺细胞及抗人T细胞兔免疫球蛋白与CD8抗原共定位的细胞比例略低于两种工艺制备的P-ATG。结论低温乙醇法与硫酸铵盐析法制备的P-ATG体外活性具有良好的一致性,且在临床剂量下不低于进口同类型制品。

盐析法与低温乙醇法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白工艺的对比

目的两种常用抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte porcine immunoglobulin)制备工艺的对比。方法以人T淋巴细胞免疫的健康猪血浆为原料,采用硫酸铵-Sephadex A-50和Cohn低温乙醇法,经醛化人健康红细胞、醛化人胎盘渣及混合人血浆吸收后,制备抗人T细胞猪免疫球蛋白,参考《中国药典》三部(2010版)相关附录,进行中间品及成品检定。结果用硫酸铵盐析法与低温乙醇法连续分别制备了3批产品,每批投浆量约5 000 ml;3批中间品鉴别试验及3批成品检定结果均符合《中国药典》三部(2010版)相关要求,两种工艺方法均适用于制备抗人T细胞猪免疫球蛋白,但在质量和收获率上,低温乙醇法更具优势。结论低温乙醇法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白更适用于生产。

α2-巨球蛋白活性检测方法的建立与优化

目的建立α2-巨球蛋白(α2-macroglobulin,α2-M)活性检测方法,检测Cohn组分Ⅳ中α2-M的活性。方法α2-M可与胰蛋白酶相互作用形成"α2-M-胰蛋白酶复合物",利用酶标仪检测出"α2-M-胰蛋白酶复合物"与小分子底物Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐(Na-benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride,BAPNA)显色反应后的光密度值(410 nm),根据建立的血浆α2-M活性标准曲线,定量计算出Cohn组分Ⅳ浓缩液中α2-M的活性。结果通过对实验体系中几个关键实验条件进行优化,建立了血浆α2-M活性标准曲线,并计算出Cohn组分Ⅳ浓缩液中α2-M活性的平均值为1.578 PU/ml。结论以正常人混合血浆作为参考标准品,用发色底物法检测Cohn组分Ⅳ浓缩液中α2-M的活性,方法简便易行,为α2-M制备过程中活性测定提供了实验基础。

离子交换层析分离纯化人结合珠蛋白的研究

目的探索应用离子交换层析从Cohn组分Ⅳ分离纯化人结合珠蛋白(haptoglobin,Hp)的方法,并对纯化产物进行初步鉴定及活性分析。方法 Cohn组分Ⅳ溶解液稀释后经利凡诺络合,收集上清并用50%硫酸铵进行沉淀,沉淀重溶后用Q Sepharose Fast Flow层析分离纯化得到目的蛋白。然后利用SDS-PAGE及免疫印迹对目的蛋白进行鉴定,并利用Native-PAGE方法测定纯化产物的活性。结果 Cohn组分Ⅳ经过利凡诺络合及盐析处理后能有效去除部分杂蛋白,并使目的蛋白富集。利用离子交换层析方法从Cohn组分Ⅳ中纯化得到的主要产物为Hp2-2,SDS-PAGE显示Hp纯度较好,免疫印迹分析进一步证明,利用该法成功分离得到目的蛋白Hp,且利用NativePAGE方法测得目的蛋白活性为2.8 U/ml。结论利用该法从Cohn组分Ⅳ中成功分离得到人Hp,方法简单,易于放大生产,具有较好应用前景。

人血清转铁蛋白标准物质纯化

建立了一种从Cohn血浆分离副产物组分IV中纯化高纯度转铁蛋白（Tf）标准物质的技术,对Cohn组分IV进行复溶、离心和过滤,采用Capto DEAE阴离子交换色谱进行初分离,再通过穿透式Octyl-Sepharose 4 Fast Flow疏水色谱进一步精制;对纯化产品进行了结构、纯度、活性等表征,采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、高效液相色谱及酶联免疫吸附法对Tf标准物质进行了分析.结果表明,Tf产品纯度大于99%,收率为79%;圆二色光谱分析显示Tf的二级结构未发生改变,铁离子结合能力实验表明Tf可结合2个铁离子,保持活性.

人α1抗胰蛋白酶的分离纯化及其对C-BSA型大鼠肾炎模型的影响

目的分离纯化α1抗胰蛋白酶(alpha 1-antitrypsin,AAT),并评价其对C-BSA型大鼠肾炎模型的影响。方法以Cohn组分Ⅳ(Cohn frcationⅣ,FⅣ)为原料,采用Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和S-200凝胶过滤柱层析纯化AAT,底物显色法检测其生物学活性。建立阳离子化小牛血清蛋白型大鼠肾炎模型,分别注射5.75和11.5 mg/kg的AAT,同时设正常组(未建模),隔日经大鼠腹腔注射给药1次,连续注射4周,模型组和正常组注射等体积的PBS。检测各组大鼠的尿常规及24 h尿液总蛋白量,并对肾脏组织进行病理学检查,同时检测肾脏中IgG沉积及AAT、Desmin、Nephrin、Podocin的表达情况。结果纯化的AAT纯度为96%,浓度为11.85 mg/mL,活性回收率为47.67%,比活为5.37。与模型组比较,高剂量AAT组大鼠24 h尿蛋白量明显降低(P<0.05),尿常规部分指标有所改善,肾小球体积增大程度有所减轻;高、低剂量AAT组大鼠肾小球IgG沉积均略减少(P>0.05),肾小球与肾小管AAT阳性表达量明显增加(P<0.001),肾小球Desmin蛋白有减轻趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);高剂量AAT组大鼠肾小球Nephrin及Podocin蛋白均明显增多(P<0.05),低剂量AAT组略有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论本纯化工艺可获得纯度较高的AAT,其对大鼠肾炎具有一定提高疗效的作用。

低温乙醇法与硫酸铵盐析法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白的质量对比研究

目的采用低温乙醇法试制抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human Tlymphocyte porcine immunoglobulin,P-ATG),并对最终制品与原硫酸铵盐析法工艺制品进行质量对比研究,评价其质量特性。方法采用《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)2015版(三部)中关于P-ATG的制品质量标准及扩展质量研究对商业化规模3批原硫酸铵盐析法及3批低温乙醇法P-ATG制品进行质量对比研究。结果3批低温乙醇法制品与硫酸铵盐析法制品均达到《中国药典》2015版(三部)中制品质量标准;扩展研究中,2种工艺制品的远紫外CD均值为93.43%,近紫外CD均值为97.68%,远紫外/近紫外CD相似度CV值均<0.5%;热稳定性结果显示,2种工艺制品的T_(m)值除T_(m2)外(P=0.031),差异均无统计学意义(P>0.05)。表明低温乙醇法工艺稳定性良好,批间差异较小,与硫酸铵盐析法具有良好的可比性。结论采用低温乙醇法可获得品质良好的P-ATG制品,可作为P-ATG的生产工艺。

低温乙醇法和硫酸铵盐析法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白的非临床安全性评价

目的采用低温乙醇法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte porcine immunoglobulin,P-ATG),并对其进行多项非临床研究,同时与原硫酸铵盐析工艺制品(市售制品)进行非临床对比研究,评价2种制品在毒理特性方面的一致性。方法给予新西兰兔的血管重复刺激性试验,评价2种制品对注射部位的局部反应;新西兰兔红细胞的体外溶血试验,评价2种制品的溶血性;单次给药静脉注射SD大鼠进行毒性试验,评价2种制品的急性毒性;4周重复给药静脉注射SD大鼠进行毒性并伴随局部刺激性、免疫原性和毒代动力学试验,评价2种制品的长期毒性。结果2种工艺制品连续5 d静脉注射新西兰兔,未见局部刺激性;2种工艺制品体外对新西兰兔红细胞无溶血作用,不引起新西兰兔红细胞凝聚;供试品组(低温乙醇法)在累计剂量1560 mg/kg和市售对照组(硫酸铵盐析法)在累计剂量1640 mg/kg的情况下,单次静脉注射SD大鼠产生的急性毒性反应相同,未显示出明显毒性,P-ATG(低温乙醇法)最大耐受量(maximum tolerance dose,MTD)>1560 mg/kg,为等效剂量的10.4倍,临床拟用剂量的62.4倍;供试品组(低温乙醇法)低、中、高剂量组分别在每日剂量195、310、780 mg/kg的情况下,重复静脉注射SD大鼠未出现明显毒性;供试品组(低温乙醇法)中剂量组在每日剂量310 mg/kg和市售对照组(硫酸铵盐析法)在每日剂量410 mg/kg的情况下,重复静脉注射SD大鼠产生的毒性特征基本一致,毒性结果变化趋势也较为接近,P-ATG(低温乙醇法)的未见明显毒性作用剂量(no observed adverse effect level,NOAEL)为780 mg/kg,为等效剂量的5.2倍,临床拟用剂量的31.2倍。结论低温乙醇法制品和硫酸铵盐析法制品的毒理特性具有良好的一致性。