从Cohn氏法组分Ⅲ沉淀纯化人凝血因子Ⅶ

目的探索从Cohn氏法组分Ⅲ(组分Ⅲ)沉淀中纯化人凝血因子Ⅶ(FⅦ)的方法并对纯化产物进行鉴定。方法将组分Ⅲ沉淀溶解,经柠檬酸钡吸附、洗脱、硫酸铵沉淀、2次DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤纯化人FⅦ。结果从400g组分Ⅲ沉淀中最终得到10.1mg纯化的FⅦ,活性为1775.8U/mg,FⅦ被浓缩了近6000倍,总活性回收率为17.6%,SDS-PAGE电泳鉴定只有1条主条带。结论组分Ⅲ沉淀中有很高FⅧ活性;建立了从组分Ⅲ沉淀中纯化人FⅦ的方法。

低温乙醇法与硫酸铵盐析法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白的质量对比研究

目的采用低温乙醇法试制抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human Tlymphocyte porcine immunoglobulin,P-ATG),并对最终制品与原硫酸铵盐析法工艺制品进行质量对比研究,评价其质量特性。方法采用《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)2015版(三部)中关于P-ATG的制品质量标准及扩展质量研究对商业化规模3批原硫酸铵盐析法及3批低温乙醇法P-ATG制品进行质量对比研究。结果3批低温乙醇法制品与硫酸铵盐析法制品均达到《中国药典》2015版(三部)中制品质量标准;扩展研究中,2种工艺制品的远紫外CD均值为93.43%,近紫外CD均值为97.68%,远紫外/近紫外CD相似度CV值均<0.5%;热稳定性结果显示,2种工艺制品的T_(m)值除T_(m2)外(P=0.031),差异均无统计学意义(P>0.05)。表明低温乙醇法工艺稳定性良好,批间差异较小,与硫酸铵盐析法具有良好的可比性。结论采用低温乙醇法可获得品质良好的P-ATG制品,可作为P-ATG的生产工艺。

低温乙醇法和硫酸铵盐析法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白的非临床安全性评价

目的采用低温乙醇法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte porcine immunoglobulin,P-ATG),并对其进行多项非临床研究,同时与原硫酸铵盐析工艺制品(市售制品)进行非临床对比研究,评价2种制品在毒理特性方面的一致性。方法给予新西兰兔的血管重复刺激性试验,评价2种制品对注射部位的局部反应;新西兰兔红细胞的体外溶血试验,评价2种制品的溶血性;单次给药静脉注射SD大鼠进行毒性试验,评价2种制品的急性毒性;4周重复给药静脉注射SD大鼠进行毒性并伴随局部刺激性、免疫原性和毒代动力学试验,评价2种制品的长期毒性。结果2种工艺制品连续5 d静脉注射新西兰兔,未见局部刺激性;2种工艺制品体外对新西兰兔红细胞无溶血作用,不引起新西兰兔红细胞凝聚;供试品组(低温乙醇法)在累计剂量1560 mg/kg和市售对照组(硫酸铵盐析法)在累计剂量1640 mg/kg的情况下,单次静脉注射SD大鼠产生的急性毒性反应相同,未显示出明显毒性,P-ATG(低温乙醇法)最大耐受量(maximum tolerance dose,MTD)>1560 mg/kg,为等效剂量的10.4倍,临床拟用剂量的62.4倍;供试品组(低温乙醇法)低、中、高剂量组分别在每日剂量195、310、780 mg/kg的情况下,重复静脉注射SD大鼠未出现明显毒性;供试品组(低温乙醇法)中剂量组在每日剂量310 mg/kg和市售对照组(硫酸铵盐析法)在每日剂量410 mg/kg的情况下,重复静脉注射SD大鼠产生的毒性特征基本一致,毒性结果变化趋势也较为接近,P-ATG(低温乙醇法)的未见明显毒性作用剂量(no observed adverse effect level,NOAEL)为780 mg/kg,为等效剂量的5.2倍,临床拟用剂量的31.2倍。结论低温乙醇法制品和硫酸铵盐析法制品的毒理特性具有良好的一致性。

低温乙醇法和硫酸铵盐析法制备的抗人T细胞猪免疫球蛋白与同类型兔源性制品体外活性的比对

目的比较低温乙醇法和硫酸铵盐析法制备的抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte porcine immunoglobulin,P-ATG)与市售的抗人胸腺细胞及抗人T细胞兔免疫球蛋白的体外活性,以评价两种工艺制备的P-ATG的性能。方法采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)法检测4种制品杀伤靶细胞的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)效应;CCK-8法检测4种制品杀伤靶细胞的补体依赖性细胞毒作用(complement dependent cytotoxicity,CDC)效应;细胞双重免疫荧光标记法检测4种制品与不同T细胞抗原(CD3、CD4、CD8)的共定位情况。结果4种制品中,仅抗人胸腺细胞兔免疫球蛋白在高浓度(1 mg/mL)下对人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)有较弱的ADCC效应;4种制品均可介导人PBMC产生CDC效应,且呈剂量依赖性,其中抗人胸腺细胞兔免疫球蛋白的活性较高,为两种工艺制备的P-ATG或抗人T细胞兔免疫球蛋白的3~4倍,抗人T细胞兔免疫球蛋白的活性与P-ATG相当;4种制品与T细胞表面抗原CD3、CD4的共定位细胞比例相近,抗人胸腺细胞及抗人T细胞兔免疫球蛋白与CD8抗原共定位的细胞比例略低于两种工艺制备的P-ATG。结论低温乙醇法与硫酸铵盐析法制备的P-ATG体外活性具有良好的一致性,且在临床剂量下不低于进口同类型制品。