α_1-抗胰蛋白酶的分离纯化

为建立从Cohn′s组分IV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)的技术路线,以Cohn′s组分IV为原料,利用还原剂1,4-二硫苏糖醇(DTT)、气相二氧化硅等处理,再经压滤、离子交换层析和疏水层析提取α1-AT。用SDS-PAGE及合成基质法检测α1-AT的纯度以及生物活性。结果可见,Cohn组分IV沉淀中α1-AT占蛋白总量的11%～13%,经该工艺提取的α1-抗胰蛋白酶纯度为97.6%,疏水层析后α1-AT的收获率为21%,比活为每毫克总蛋白中含0.54mg功能活性α1-AT。可见用此方法从Cohn组分IV沉淀中可制备高纯度的α1-AT。

人α1抗胰蛋白酶的分离纯化及其对C-BSA型大鼠肾炎模型的影响

目的分离纯化α1抗胰蛋白酶(alpha 1-antitrypsin,AAT),并评价其对C-BSA型大鼠肾炎模型的影响。方法以Cohn组分Ⅳ(Cohn frcationⅣ,FⅣ)为原料,采用Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和S-200凝胶过滤柱层析纯化AAT,底物显色法检测其生物学活性。建立阳离子化小牛血清蛋白型大鼠肾炎模型,分别注射5.75和11.5 mg/kg的AAT,同时设正常组(未建模),隔日经大鼠腹腔注射给药1次,连续注射4周,模型组和正常组注射等体积的PBS。检测各组大鼠的尿常规及24 h尿液总蛋白量,并对肾脏组织进行病理学检查,同时检测肾脏中IgG沉积及AAT、Desmin、Nephrin、Podocin的表达情况。结果纯化的AAT纯度为96%,浓度为11.85 mg/mL,活性回收率为47.67%,比活为5.37。与模型组比较,高剂量AAT组大鼠24 h尿蛋白量明显降低(P<0.05),尿常规部分指标有所改善,肾小球体积增大程度有所减轻;高、低剂量AAT组大鼠肾小球IgG沉积均略减少(P>0.05),肾小球与肾小管AAT阳性表达量明显增加(P<0.001),肾小球Desmin蛋白有减轻趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);高剂量AAT组大鼠肾小球Nephrin及Podocin蛋白均明显增多(P<0.05),低剂量AAT组略有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论本纯化工艺可获得纯度较高的AAT,其对大鼠肾炎具有一定提高疗效的作用。

离子交换层析分离纯化人结合珠蛋白的研究

目的探索应用离子交换层析从Cohn组分Ⅳ分离纯化人结合珠蛋白(haptoglobin,Hp)的方法,并对纯化产物进行初步鉴定及活性分析。方法 Cohn组分Ⅳ溶解液稀释后经利凡诺络合,收集上清并用50%硫酸铵进行沉淀,沉淀重溶后用Q Sepharose Fast Flow层析分离纯化得到目的蛋白。然后利用SDS-PAGE及免疫印迹对目的蛋白进行鉴定,并利用Native-PAGE方法测定纯化产物的活性。结果 Cohn组分Ⅳ经过利凡诺络合及盐析处理后能有效去除部分杂蛋白,并使目的蛋白富集。利用离子交换层析方法从Cohn组分Ⅳ中纯化得到的主要产物为Hp2-2,SDS-PAGE显示Hp纯度较好,免疫印迹分析进一步证明,利用该法成功分离得到目的蛋白Hp,且利用NativePAGE方法测得目的蛋白活性为2.8 U/ml。结论利用该法从Cohn组分Ⅳ中成功分离得到人Hp,方法简单,易于放大生产,具有较好应用前景。

α2-巨球蛋白活性检测方法的建立与优化

目的建立α2-巨球蛋白(α2-macroglobulin,α2-M)活性检测方法,检测Cohn组分Ⅳ中α2-M的活性。方法α2-M可与胰蛋白酶相互作用形成"α2-M-胰蛋白酶复合物",利用酶标仪检测出"α2-M-胰蛋白酶复合物"与小分子底物Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐(Na-benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride,BAPNA)显色反应后的光密度值(410 nm),根据建立的血浆α2-M活性标准曲线,定量计算出Cohn组分Ⅳ浓缩液中α2-M的活性。结果通过对实验体系中几个关键实验条件进行优化,建立了血浆α2-M活性标准曲线,并计算出Cohn组分Ⅳ浓缩液中α2-M活性的平均值为1.578 PU/ml。结论以正常人混合血浆作为参考标准品,用发色底物法检测Cohn组分Ⅳ浓缩液中α2-M的活性,方法简便易行,为α2-M制备过程中活性测定提供了实验基础。

人血清转铁蛋白标准物质纯化

建立了一种从Cohn血浆分离副产物组分IV中纯化高纯度转铁蛋白（Tf）标准物质的技术,对Cohn组分IV进行复溶、离心和过滤,采用Capto DEAE阴离子交换色谱进行初分离,再通过穿透式Octyl-Sepharose 4 Fast Flow疏水色谱进一步精制;对纯化产品进行了结构、纯度、活性等表征,采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、高效液相色谱及酶联免疫吸附法对Tf标准物质进行了分析.结果表明,Tf产品纯度大于99%,收率为79%;圆二色光谱分析显示Tf的二级结构未发生改变,铁离子结合能力实验表明Tf可结合2个铁离子,保持活性.