结直肠腺癌中COL9A1蛋白的表达及其临床意义

目的:探讨微环境中Ⅸ型胶原α1(collagen type IX alpha 1 chain,COL9A1)在结直肠腺癌中的表达及其与肿瘤进展的相关性和临床意义。方法:收集2012年1月至2021年1月手术切除的结直肠癌标本408例,采用免疫组织化学检测结直肠腺癌肿瘤组织及癌旁正常组织中COL9A1表达,同时检测肿瘤组织中肿瘤蛋白53(tumor protein 53,P53)和错配修复(mismatch repair,MMR)蛋白MLH1、MSH6和PMS2的表达,统计分析COL9A1的表达与各临床病理特征参数的关系,以及与P53突变和MMR状态的相关性,并分析COL9A1阳性表达患者的预后情况。结果:COL9A1在结直肠腺癌肿瘤组织中表达显著低于癌旁正常组织(P<0.001);COL9A1的表达与肿瘤浸润深度、临床分期和肠系膜淋巴结转移有关(χ^(2)=16.943、89.031和84.814;均P<0.001),而与P53突变和MMR状态无关(χ^(2)=0.677、1.260,均P>0.05);Log-rank检验显示COL9A1阴性表达患者的无进展生存期(progression free survival,PFS)和总体生存期(overall survival,OS)显著低于COL9A1阳性表达患者(分别P<0.001,P=0.040)。结论:结直肠腺癌中COL9A1蛋白的表达缺失与肿瘤浸润及转移密切相关,并提示不良预后,这可为结直肠癌预后评估、药物筛选等提供可能的分子标志物和治疗策略。

ACLP、COL11A1在胰腺癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系

目的研究胰腺癌中主动脉羧肽酶类样蛋白(ACLP)、Ⅺ型胶原α1(COL11A1)表达及临床预后价值。方法回顾性选择2019年1月—2021年1月陕西省肿瘤医院中西医科和陕西中医药大学附属医院肿瘤科手术治疗的胰腺癌患者88例为研究对象。采用实时荧光定量PCR和免疫组织化学检测癌组织及癌旁组织中ACLP、COL11A1 mRNA表达和蛋白水平;Pearson相关分析ACLP mRNA与COL11A1 mRNA的相关性;Kaplan-Meier法分析ACLP、COL11A1表达对胰腺癌患者生存预后的影响;Cox回归分析胰腺癌预后的影响因素。结果胰腺癌患者癌组织ACLP、COL11A1 mRNA的相对表达量高于癌旁组织(t/P=31.058/<0.001,27.642/<0.001);胰腺癌患者癌组织中ACLP、COL11A1阳性率分别为69.32%(61/88)、70.45%(62/88),高于癌旁组织的9.09%(8/88)、6.82%(6/88),差异有统计学意义(χ^(2)=66.963、75.155,P均<0.001);胰腺癌组织中ACLP mRNA与COL11A1 mRNA表达呈正相关(r=0.642,P<0.001);TNM分期ⅡB~Ⅲ期、有淋巴结转移的胰腺癌组织中ACLP、COL11A1蛋白阳性率高于TNM分期Ⅰ~ⅡA期、无淋巴结转移(ACLP:χ^(2)/P=19.704/<0.001、12.908/<0.001;COL11A1:χ^(2)/P=22.440/<0.001、14.569/<0.001)。ACLP阳性组3年总生存率为22.95%(14/61),低于阴性组44.44%(12/27),差异有统计学意义(Log rankχ^(2)=5.433,P=0.020);COL11A1阳性组3年总生存率为20.97%(13/62),低于阴性组50.00%(13/26),差异有统计学意义(Log rankχ^(2)=7.281,P=0.007)。TNM分期ⅡB~Ⅲ期、淋巴结转移、ACLP阳性、COL11A1阳性是影响胰腺癌患者预后的独立危险因素[HR(95%CI)=1.781(1.199~2.646),1.962(1.172~3.285),1.505(1.066~2.125),1.568(1.117~2.201)]。结论胰腺癌组织中ACLP、COL11A1 mRNA表达和蛋白水平均明显上调,二者在胰腺癌的发生和进展中发挥促进作用,是新的临床上评估胰腺癌患者预后的标志物。

鹿瓜多肽注射液对CⅡ诱导的免疫性关节炎大鼠关节滑膜组织MMP_3和TIMP-1mRNA表达的影响

目的 :探讨鹿瓜多肽注射液治疗类风湿性关节炎 (RA)的机理。方法 :以Ⅱ型胶原 (CⅡ )诱导的免疫性关节炎 (CIA)大鼠为RA动物模型 ,通过测量其关节肿胀程度及制作病理切片并在光镜下计分 ,观察鹿瓜多肽注射液对其的治疗效果 ,并取膝关节滑膜切片进行原位杂交 ,用图像分析系统检测MMP3 和TIMP 1mRNA表达水平。结果 :与模型组比较 ,鹿瓜多肽组大鼠踝关节肿胀程度和病理损伤计分均明显减轻。模型组大鼠滑膜组织MMP3 mRNA表达阳性密度明显高于正常对照组 ,而TIMP 1mRNA表达阳性密度明显低于正常对照组。鹿瓜多肽组大鼠滑膜组织MMP3 表达降低 ,TIMP 1表达增高。结论 :鹿瓜多肽注射液对CⅡ诱导的免疫性关节炎有治疗作用 ,其机理可能与抑制滑膜组织MMP3 mRNA表达并促进TIMP 1mRNA表达有关。

T140体外阻断SDF-1/CXCR4信号通路阻止人关节软骨Ⅱ型胶原蛋白降解的研究

目的:探讨T140体外阻断基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor 1,SDF-1)/趋化因子受体4(chemokine receptor 4,CXCR4)信号通路对人关节软骨细胞降解Ⅱ型胶原蛋白的影响,明确T140的作用机制。方法:取144块膝关节置换OA患者软骨(OA软骨组)和144块创伤性截肢患者正常软骨(正常软骨组)组织,Mankin评分均为0或1,加入SDF-1(100 ng/mL)。每组再分为A、B、C三个亚组,分别加入浓度为1 000 nmol/L的T140、MAB310和SDF-1,分别于体外培养2、4 d后,采用RT-PCR检测软骨组织Ⅱ型胶原蛋白mRNA表达。结果:相同软骨组在相同时间点,A组Ⅱ型胶原蛋白mRNA表达均显著高于B组和C组(P<0.05)。相同时间点,OA软骨组同一亚组Ⅱ型胶原蛋白mRNA表达均显著低于正常软骨组(P<0.05)。结论:SDF-1通过SDF-1/CXCR4信号通路诱导人关节软骨降解Ⅱ型胶原蛋白;T140阻断SDF-1/CXCR4信号通路,缓解软骨细胞降解Ⅱ型胶原蛋白。

软骨下骨刚度增加对关节软骨Ⅱ型胶原和MMP-1表达的影响

目的观察增加软骨下骨刚度后关节软骨中Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的表达和分布,探讨骨关节炎发病机制。方法调整聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、羟基磷灰石(HA)和蒸馏水的比例,使反应温度低于40℃,制成PMMA-HA复合材料。刮除兔胫骨内侧软骨下骨后置入复合材料,对术后3、6、9、12周的关节软骨进行组织学观察,免疫组化法检测Ⅱ型胶原和MMP-1在软骨中的表达和分布,并与空白、对照组相比较。结果复合材料以HA 2g、PMMA 1g、MMA 0.7ml、蒸馏水0.3ml混合时平均最高反应温度为38.17℃,且极限强度和刚度均高于软骨下骨。实验显示关节软骨随的时间的延长出现纤维化、裂隙、变薄,软骨细胞簇集,潮线模糊或消失,Mankin分级逐渐升高;免疫组化显示Ⅱ型胶原表达增加主要在软骨移行层和深层上部,MMP-1表达以软骨表层及中上层居多,两者染色强度随观察时间的延长均逐渐升高。结论软骨下骨刚度增加后软骨中Ⅱ型胶原和MMP-1表达的量均升高,提示软骨下骨硬化对关节软骨退变的发生、发展具有十分重要的作用,可能为骨关节炎发病的主要原因之一。

T140靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路对豚鼠关节软骨Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的影响

目的:明确T140体内靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路对豚鼠关节软骨Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的影响,探讨T140减缓软骨退变的作用。方法:健康9月龄雄性Hartley豚鼠36只,随机分成A、B、C三组,A组为实验组,B组为实验对照组,C组为空白对照组,每组12只。于12周时,获取膝关节软骨,采用RT-PCR法检测Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ)及聚集蛋白聚糖m RNA的表达;Western blot检测ColⅡ含量。结果:RT-PCR检测结果显示A组Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的m RNA表达量高于B、C组,差异有统计学意义(P<0.05);Western blot检测结果发现A组ColⅡ含量高于B、C组(P<0.05)。结论:T140于体内靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路,减少关节软骨Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的降解,进而减缓关节软骨的退变。

血管紧张素-(1-7)及丝裂原活化蛋白激酶激酶抑制剂U0126对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠右心室心肌成纤维细胞增殖的影响

目的通过大鼠右心室心肌成纤维细胞(RVCFs)体外培养,探讨血管紧张素(Ang)-(1-7)及丝裂原活化蛋白激酶激酶抑制剂U0126对AngⅡ诱导的RVCFs的影响。方法提取乳大鼠RVCFs,经过抗波形蛋白免疫荧光法鉴定,传代培养至第3代,随机分为对照组、AngⅡ组、Ang-(1-7)组(分为低、中、高剂量组)、U0126组(分为低、中、高剂量组)。采用噻唑蓝比色法测定各组细胞增殖情况;蛋白质印迹法检测各组Ⅰ型胶原蛋白α1(COL1A1)表达水平;免疫组织化学法测定转化生长因子β1(TGF-β1)表达水平。结果AngⅡ组RVCFs的细胞增殖率明显高于对照组[(141.7±9.6)%比(100.0±0.0)%],Ang-(1-7)低、中、高剂量组,U0126低、中、高剂量组RVCFs的细胞增殖率[(118.2±4.9)%、(52.1±5.9)%、(43.6±2.5)%,(43.0±2.3)%、(43.3±3.7)%、(49.4±4.6)%]均显著低于AngⅡ组(均P<0.05),且Ang-(1-7)对RVCFs增殖的抑制作用呈剂量反应关系。AngⅡ能促进RVCFs COL1A1表达,Ang-(1-7)及U0126对AngⅡ诱导的COL1A1表达均有抑制作用。TGF-β1免疫组化阳性反应分级示对照组(+)、AngⅡ组(+++)、Ang-(1-7)组(++)、U0126组(+)。结论Ang-(1-7)、U0126可部分抵消AngⅡ刺激导致的RVCFs增殖,抑制TGF-β1和COL1A1的蛋白表达。

LncRNA COL1A2-AS1调控人瘢痕疙瘩成纤维细胞功能的研究

目的研究长链非编码RNA(LncRNA)Ⅰ型胶原α2自然反义转录物1(COL1A2-AS1)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡、迁移的影响。方法在COL1A2-AS1的功能研究中将人成纤维细胞分为3组:空白组、空载组、COL1A2-AS1-过表达组。qRT-PCR检测miR-181a-5p、TGF-β1、Smad7、Col-Ⅲ、COL1A2-AS1的表达。CCK-8法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell法检测细胞迁移,Western blot检测TGF-β1、Smad7、Col-Ⅲ蛋白的表达水平。双荧光素酶报告实验验证COL1A2-AS1与所预测的靶标miR-181a-5p的结合关系。结果与空载组比较,COL1A2-AS1-过表达组的人成纤维细胞增殖OD值、迁移细胞数以及Col-Ⅲ的表达都明显下调(P<0.05),而TGF-β1和Smad7的表达水平都明显升高(P<0.05)。与空载组比较,COL1A2-AS1-过表达组细胞的凋亡率增加(P<0.05)。另外,与空载组比较,COL1A2-AS1-过表达组明显抑制miR-181a-5p的表达(P<0.05),且经过双荧光素酶报告实验验证COL1A2-AS1和miR-181a-5p可直接结合。结论COL1A2-AS1直接靶向抑制miR-181a-5p的表达,并抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和迁移,促进细胞的凋亡。

BMP-7与IL-6对人髓核细胞ColⅡ与TIMP-1基因表达的影响

目的探讨不同浓度BMP-7与IL-6作用于体外培养的人髓核细胞对Ⅱ型胶原与TIMP-1基因表达的影响。方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测不同浓度BMP-7与IL-6作用下体外培养的人髓核细胞中TIMP-1和Ⅱ型胶原基因的表达量。结果IL-6可以下调Ⅱ型胶原基因和TIMP-1基因表达;低浓度的BMP-7可以抵消相同浓度IL-6对髓核细胞的保护作用,高浓度的BMP-7可以促进Ⅱ型胶原基因和TIMP-1基因表达。结论BMP-7可以对抗IL-6作用和正向调节椎间盘细胞Ⅱ型胶原基因及TIMP-1基因表达,提示BMP-7在临床治疗中可能具有逆转早期椎间盘退变的作用。

人参皂苷Rg1对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响

背景:人参是具有抗炎、抗应激、调节免疫等广泛药理学活性的中草药,其主要药理活性成分是人参皂苷,而Rg1是含量较多的活性成分。目的:探讨人参皂苷Rg1对白细胞介素1β诱导的人骨关节炎模型中软骨细胞Ⅱ型胶原及环氧合酶2mRNA表达的影响。方法:取因骨关节炎接受全膝关节置换患者的膝关节软骨进行体外培养,取第2代体外培养的软骨细胞,CCK-8检测0.001,0.01,0.1,1,10,100mg/L人参皂苷Rg1对软骨细胞增殖率的影响。再将第2代体外培养的关节软骨细胞,随机分为空白组、对照组和实验组,分别加入DMEM培养液、10μg/L白细胞介素1β,10μg/L白细胞介素1β+0.1,1,10,100mg/L人参皂苷Rg1,培养24h后反转录PCR检测各组细胞中Ⅱ型胶原和环氧合酶2mRNA的表达。结果与结论:与对照组相比,人参皂苷Rg1质量浓度为0.001,0.01,0.1,1mg/L时促进软骨细胞的增殖作用不明显,差异无显著性意义(P>0.05);当人参皂苷Rg1质量浓度为10,100mg/L时,促进软骨细胞的增殖作用明显(P<0.05)。与空白组相比,对照组的软骨细胞Ⅱ型胶原的mRNA表达明显下降,而环氧合酶2mRNA表达明显升高(P<0.05);与对照组相比,联合加入人参皂苷Rg1质量浓度为0.1和1mg/L时,人软骨细胞中Ⅱ型胶原和环氧合酶2mRNA表达没有明显变化(P>0.05);而联合加入人参皂苷Rg1质量浓度为10和100mg/L时,人软骨细胞中Ⅱ型胶原mRNA表达增加,而环氧合酶2mRNA表达降低(P<0.05)。说明一定浓度的人参皂苷Rg1可以拮抗白细胞介素1β引起的人软骨细胞中Ⅱ型胶原的mRNA表达的降低和环氧合酶2mRNA表达的升高。

乳腺癌组织中COL11A1表达与ER、PR、HER-2和Ki-67的相关性分析

目的探讨乳腺癌组织中Ⅺ型胶原α1(COL11A1)表达与雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体-2(HER-2)和Ki-67的关系。方法采用免疫组化EnVision两步法检测18例乳腺纤维腺瘤组织和120例乳腺癌组织(36例原位癌组织、84例浸润性癌组织)中COL11A1的表达,同时对乳腺癌组织进行ER、PR、HER-2和Ki-67免疫组化检测,对HER-2(2+)进行荧光原位杂交检测;分析COL11A1表达与乳腺癌临床病理特征和多种免疫标记(ER、PR、HER-2和Ki-67)的关系。结果免疫组化结果显示COL11A1主要表达于乳腺癌细胞中。在纤维腺瘤组织中COL11A1表达呈弱阳性。COL11A1在原位癌中表达高于浸润性乳腺癌(P<0.05)。COL11A1表达与乳腺癌患者的年龄、部位、肿块大小和淋巴结转移无关(P>0.05),而中、高分化组织的COL11A1表达水平高于低分化组织,差异有统计学意义(P<0.05)。进一步分析COL11A1与乳腺癌其他免疫标记间的相关性发现,在Ki-67高表达组织中COL11A1低表达的比例更高,差异有统计学意义(P<0.05),而其他3种标记与COL11A1的表达无关(P>0.05)。结论COL11A1在浸润性乳腺癌中表达较原位癌低,在低分化乳腺癌中表达水平较中高分化更低,且与Ki-67表达有关,提示COL11Al表达在乳腺癌发生发展过程中是动态变化的,为乳腺癌的诊断治疗提供潜在标记物。

结直肠癌组织的COL1A1和COL1A2水平及临床意义

目的探讨结直肠癌组织的Ⅰ型胶原蛋白α1链(COL1A1)和α2链(COL1A2)水平及临床意义。方法采用GEPIA分析来自TCGA数据库的367例结直肠癌(275例结肠癌+92例直肠癌)的COL1A1、COL1A2水平,实时定量PCR检测2016年1月至2018年12月手术切除的106例结直肠癌组织和93例癌旁组织的COL1A1、COL1A2水平,采用受试者工作特征(ROC)曲线评估组织两者水平诊断结直肠癌的效能,分析组织两者水平与结直肠癌临床病理特征的关系,采用GEPIA分析两者水平与结直肠癌总生存期(OS)和无病生存期(DFS)的关系。结果GEPIA在线分析显示,275例结肠癌组织的COL1A1和COL1A2水平均高于对应41例正常组织,而92例直肠癌组织中仅COL1A1水平高于10例正常组织(P<0.05)。106例结直肠癌组织的COL1A1和COL1A2水平分别为4.013±1.705和3.535±1.354,高于93例癌旁组织的1.544±0.678和1.613±0.741(P<0.05),且COL1A1和COL1A2水平呈正相关(r=0.518,P<0.001)。ROC曲线显示组织COL1A1和COL1A2水平诊断结直肠癌的曲线下面积分别为0.894(95%CI:0.848~0.941)和0.882(95%CI:0.837~0.927)。两者水平均与淋巴结转移、肿瘤直径、TNM分期和T分期有关(P<0.05)。COL1A1水平仅与DFS有关,而COL1A2水平与OS和DFS均有关,其中高水平者的OS和DFS较差。结论COL1A1和COL1A2在结直肠癌中高表达,在该肿瘤的诊断、病情预测和预后评估上有一定价值,两者共同促进了结直肠癌的发生发展。

COL4A1基因多态性与中国女性骨密度关系分析

目的 研究COL 4 A 1基因多态性与中国农村女性骨密度关系.方法 采用双能X线吸收仪对343名女性研究对象进行腰椎及股骨扫描,应用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法检测COL4 A 1基因（谷酰氨酸Q 1334 H组氨酸）多态位点基因型,用广义线性模型分析此位点多态性与腰椎2～4及股骨骨密度关系.结果 在调整环境危险因素后,均未显示COL 4 A 1基因H 1334 H基因型与股骨颈、腰椎2～4骨密度相关（P=0.409、0.705）.结论 在中国农村女性人群中COL 4 A 1基因Q 1334 H多态性与股骨颈、腰椎2～4骨密度无显著相关性.

COL4A1基因Q1334H多态性与中国男性骨密度显著相关性研究

目的研究COL4A1基因多态性与中国农村男性骨密度关系。方法采用双能X线吸收仪对367名男性研究对象进行腰椎及股骨扫描,应用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测COL4A1基因Q1334H多态位点基因型,用广义线性模型分析此位点多态性与腰椎2￣4及股骨骨密度关系。结果在调整环境危险因素前后,均显示COL4A1基因H1334H基因型与股骨颈骨密度降低呈显著相关(P=0.0074)、但与腰椎2￣4的骨密度无显著相关性(P=0.351)。结论在中国农村男性人群中COL4A1基因Q1334H多态性与股骨颈骨密度相关。

基质金属蛋白酶-3和Ⅰ型胶原α1链基因多态性对原发性冻结肩易感性的影响

目的目前原发性冻结肩的病因及发病机制在基因及分子生物学领域的研究报道较少。文中旨在探讨基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和I型胶原α1链(COL1A1)基因多态性对原发性冻结肩的易感性的影响。方法选择2016年1月至6月来南京军区南京总医院骨科就诊的42名原发性冻结肩患者为病例组,50名健康受试者作为对照组。对所有研究对象的MMP-3基因多态性rs679620及rs522616与COL1A1基因多态性rs1107946,分别进行基因型测定。结果 MMP-3多态性位点rs679620基因型分布与原发性冻结肩易感性无明显相关性(P>0.05)。等位基因A与G比较,差异有统计学意义(OR=0.54,95%CI:0.30~0.99,P=0.044)。COL1A1多态性位点rs1107946基因型及等位基因频率与原发性冻结肩易感性无明显相关性(P=0.994、0.920)。与隐性遗传模型GG相比,GT、TT和GT+TT差异无统计学意义;等位基因T与G比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 MMP-3基因多态性rs679620等位基因A是原发性冻结肩发病的保护性因素。MMP-3基因多态性rs522616和COL1A1基因多态性rs1107946与原发性冻结肩易感性无关。

重组人白细胞介素-1受体拮抗剂对大鼠胶原性关节炎的治疗作用

目的 研究重组人白细胞介素 1受体拮抗剂 (recom binanthumaninterleukin1receptorantagonist, rhIL 1ra)对大鼠胶原性关节炎 (collagen inducedarthritis,CIA)的治疗作用。方法 SD大鼠随机分为 6组:正常对照组、模型组、rhIL 1ra3个剂量组和进口IL 1ra组;采用Ⅱ型胶原(CⅡ)乳剂皮内注射诱导大鼠CIA模型;每周测体重观察体重变化;足爪容积法测量大鼠足爪肿胀度;测定CⅡ的迟发性变态反应(DTH);ELISA法检测血清中抗Ⅱ型胶原抗体水平;同时进行病理组织学的检查。结果 CIA大鼠在致炎d10,出现关节红、肿,体重减轻,血清抗CⅡ抗体水平升高,关节病理可见滑膜增生,炎性细胞浸润,血管翳形成,软骨和骨的破坏等。rhIL 1ra(7 5, 30, 120mg·kg-1 )和阳性对照组anakinra(120mg·kg-1 )皮下注射,连续 7d,能明显抑制CIA大鼠足肿胀;rhIL 1ra(30, 120mg·kg-1 )皮下注射,连续 7d,可以明显减轻CⅡ诱发的迟发性变态反应 (DTH);另外,rhIL 1ra也可明显降低CIA大鼠血清中抗CⅡ抗体的水平;病理学检查表明,rhIL 1ra大剂量能明显减轻CIA大鼠关节滑膜炎症和滑膜增生,减轻血管翳和软骨破坏。结论 rhIL 1ra对CIA具有治疗作用。

慢病毒介导 shRNA 沉默鼠肝星状细胞 TGFβ1 对 α1Ⅰ型胶原表达的影响

目的构建大鼠转化生长因子β1(transforming growth factor,TGFβ1)基因RNA干扰慢病毒载体,并观测其对大鼠肝星状细胞HSC-T6的TGFβ1基因沉默效应与对Ⅰ型胶原α1(alpha-1 typeⅠcollagen,Col1α1)表达的影响。方法针对大鼠TGFβ1基因CDs序列,筛选3个干扰靶点,合成其3对小干扰RNA(siRNA),将各对siRNA分别转入HSC-T6细胞,采用RT-PCR法从3对siRNA中筛选出最佳siRNA,设计并合成针对最佳siRNA靶序列的shRNA,退火形成双链,与载体pGreenPuro连接,构建pGreenPuro/TGFβ1 shRNA慢病毒载体,予以酶切与测序鉴定。pGreenPuro/TGFβ1 shRNA慢病毒载体经293细胞包装,将包装产生的高感染力的慢病毒颗粒感染HSC-T6细胞,倒置显微镜观察经感染的HSC-T6细胞的GFP表达情况,在mRNA与蛋白水平检测重组慢病毒pGreenPuro/TGFβ1 shRNA对HSC-T6细胞的TGFβ1基因的沉默效应及对Col1α1表达的影响。结果筛选到TGFβ1基因的最佳干扰靶序列。酶切与测序结果证实,构建pGreenPuro/TGFβ1 shRNA慢病毒载体成功。HSC-T6细胞经pGreenPuro/TGFβ1 shRNA慢病毒感染48 h后,RT-PCR检测未见TGFβ1基因表达,Col1α1基因较弱表达;Western blot检测显示TGFβ1、Col1α1蛋白表达均非常弱。结论成功构建大鼠TGFβ1基因RNA干扰慢病毒载体,该载体能有效沉默HSC-T6细胞的TGFβ1基因,并抑制Col1α1的表达。

终末期肾脏病患者桡动脉中膜钙化与核心结合因子α_1及Ⅰ型胶原的关系研究

目的探讨终末期肾脏病（ESRD）患者桡动脉中膜钙化与核心结合因子α1（Cbfα1）及Ⅰ型胶原的关系。方法选择2009年5月—2012年12月在河北医科大学第四医院肾内科住院初次行前臂动-静脉内瘘成形术的ESRD患者62例。采用von kossa染色法观察桡动脉钙化情况,并根据组织钙化积分将患者分为无钙化组（〈1.0分）和钙化组（1.0~4.0分）;采用免疫组织化学法观察Cbfα1及Ⅰ型胶原的表达情况;检测相关临床指标〔空腹血清钙（Ca）、血清磷（P）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、血红蛋白（Hb）、碱性磷酸酶（ALP）、铁蛋白、甲状旁腺素（iPTH）和C反应蛋白（CRP）,血压,体质指数（BMI）〕。结果62例ESRD患者桡动脉标本中25例（40.3%）发生血管钙化,其中轻中度钙化22例（35.5%）,重度钙化3例（4.8%）,均发生在血管中膜。根据组织钙化积分,无钙化组37例,钙化组25例。钙化组桡动脉中膜均有Cbfα1及Ⅰ型胶原的阳性表达;无钙化组桡动脉中膜31例（83.8%）Cbfα1阳性表达,19例（51.4%）Ⅰ型胶原阳性表达。钙化组Cbfα1及Ⅰ型胶原的阳性表达积分均高于无钙化组（P〈0.05）。钙化组与无钙化组的年龄、BMI、血压、Ca、iPTH、TG、TC、LDL、HDL、Hb、CRP、铁蛋白、ALP比较,差异无统计学意义（P〉0.05）;钙化组血清P水平高于无钙化组（P〈0.05）。钙化组Cbfα1阳性表达积分与血清P呈正相关（r=0.679,P〈0.05）,与年龄、BMI、血压、血清Ca、TG、TC、LDL、HDL、iPTH、Hb、CRP、铁蛋白、ALP无相关性（P〉0.05）;Ⅰ型胶原阳性表达积分与血清P呈正相关（r=0.393,P〈0.05）,与年龄、BMI、血压、血清Ca、TG、TC、LDL、HDL、iPTH、Hb、CRP、铁蛋白、ALP无相关性（P〉0.05）;Cbfα1阳性表达积分与Ⅰ型胶原阳性表达积分呈正相关（r=0.307,P〈0.05）。结论 ESRD患者血管中膜钙化发生率较高,其发生机制可能与高磷诱导血管平滑肌细胞表型转化,促进I型胶原表达增加有关,为临床进一步研究提供了参考依据。

靶向COL1A1基因的shRNA对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨抑制Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)基因表达对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及凋亡的影响。方法:用已构建的pSilencer2.1-U6-COL1A1重组质粒转染乳腺癌细胞MDA-MB-231,采用RT-PCR和Western blotting技术检测重组质粒对COL1A1基因表达的影响,MTT比色法测定细胞增殖的抑制情况,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡的变化,Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡的形态学变化。结果:RT-PCR及Western blotting结果证实重组质粒在mRNA和蛋白水平分别显著抑制COL1A1基因表达;pshRNA-COL1A1转染组细胞的增殖速度明显减慢且呈时间依赖关系;与对照组相比,pshRNA-COL1A1组细胞明显阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率显著升高(P<0.05),出现细胞质浓缩、核凝聚等凋亡形态学变化。结论:pshRNA-COL1A1能有效抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖,并诱导其凋亡,为以COL1A1为靶点的乳腺癌基因治疗提供实验依据。

靶向人Ⅰ型胶原蛋白α1链分子的shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的构建靶向人Ⅰ型胶原蛋白α1链(COL1A1)分子的shRNA真核表达载体并检测其对靶分子的干扰效应。方法根据靶分子COL1A1基因序列,设计、合成编码其shRNA的互补寡核苷酸序列,克隆至线性化的pSilencerTM2.1-U6 neo载体中并对重组质粒进行酶切分析及测序鉴定;脂质体介导重组质粒转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,经G418筛选获稳定表达细胞株,RT-PCR及Western blot法检测其对靶分子COL1A1表达的影响。结果酶切及DNA测序证实重组质粒pshRNA-COL1A1序列正确。与对照组比较,重组表达质粒pshRNA-COL1A1-1和pshRNA-COL1A1-2在mRNA和蛋白水平均能显著抑制COL1A1基因的表达(P<0.05),抑制率分别为(44.41%±3.90%,63.05%±3.13%)及(45.50%±2.71%,66.98%±2.08%)。结论成功构建靶向人乳腺癌MDA-MB-231细胞COL1A1基因的shRNA真核表达载体。