胶原酶Ⅳ预处理对足三里穴注射庆大霉素胃电的影响

目的 :探讨穴位注药后初始药效发生中传递药物信息的物质基础。方法 :应用胶原酶Ⅳ在足三里穴上方 6mm同经 (足阳明胃经 )上预处理 ,30min后足三里穴注射庆大霉素 ,观察给药后庆大霉素对胃电的影响 ,并与等量胶原酶Ⅳ在足三里穴上方 6mm经旁 (足阳明胃经旁开 4mm)预处理组和生理盐水足三里穴上方同经预处理组相比较。结果 :胶原酶Ⅳ足三里穴上方同经上预处理能完全阻断足三里穴注射庆大霉素的初始抑制胃电的作用 ,而足阳明胃经旁预处理组和生理盐水预处理组无此阻断作用。结论 :庆大霉素足三里注射可明显抑制胃电活动。胶原Ⅳ在足三里穴注射庆大霉素后初始药效中具有传递药物信息的作用。

金荞麦提取物抑制肿瘤细胞侵袭、转移和HT-1080细胞产生Ⅳ型胶原酶的研究

目的探讨金荞麦提取物对肿瘤细胞侵袭和转移的影响。方法以人工重组基底膜及小鼠黑色素瘤高转移株自发性肺转移模型观察了金荞麦提取物对Ｂ１６－ＢＬ６细胞的体外抗侵袭活性和体内抗转移作用；用聚丙烯酰胺凝胶电泳法进一步观察了其对人纤维肉瘤ＨＴ－１０８０细胞Ⅳ型胶原酶的产生及活性的影响；同时用ＷＳＴ法观察了该药的细胞毒性。结果金荞麦提取物在１００ｍｇＬ－１剂量下能明显抑制Ｂ１６－ＢＬ６细胞侵袭；在２００ｍｇｋｇ－１剂量下能有效抑制Ｂ１６－ＢＬ６黑色素瘤细胞在Ｃ５７／ＢＬ６小鼠体内自发性肺转移。该药对Ｂ１６－ＢＬ６和ＨＴ－１０８０细胞无明显细胞毒作用。该药能抑制ＨＴ－１０８０细胞Ⅳ胶原酶的产生，但对酶的活性无明显影响。结论金荞麦提取物具有明显的抗癌侵袭和转移的作用。

表位九肽库的构建及人Ⅳ型胶原酶特异结合肽的筛选

将人工合成的编码九肽的随机序列ＤＮＡ片段克隆进丝状噬菌体表达载体ｆＵＳＥ５，经多次电击转化和表达，获得肽段与噬菌体ｐⅢ蛋白融合并展示在噬菌体表面的随机序列九肽表位肽库。库容量达１０１０个克隆。以Ⅳ型胶原酶为靶蛋白，采用亲和纯化筛选模式，从中筛选出Ⅳ型胶原酶结合肽。进一步ＥＬＩＳＡ检测筛选出与Ⅳ型胶原酶特异结合的２０个阳性克隆。序列分析发现一组肽含有ＷＤＸＸＤ的共同序列，一组含有ＷＶＧＸＸＲ的共同序列。其中ＷＤＸＸＤ的序列与Ⅳ型胶原酶单链抗体可变区序列同源。结果表明，多肽库是筛选蛋白特异结合肽的有力工具，表位九肽库的构建和筛选方法的建立为进一步应用筛选具有高亲和力的特异结合肽奠定了基础。

Ⅳ型胶原及Ⅳ型胶原酶与涎腺腺样囊性癌生物学特性的关系研究

用免疫组织化学ＡＢＣ法，观察２５例涎腺腺样囊性癌（ＡＣＣ）患者的癌组织中Ⅳ型胶原以及Ⅳ型胶原酶的表达与分布，探讨其与ＡＣＣ侵袭和转移的关系。结果显示，Ⅳ型胶原主要分布在基底膜上以及部分筛状假囊、腺管和肿瘤细胞浆内，Ⅳ型胶原酶分布在肿瘤细胞浆内及周围。经统计学检验，发现筛状－管状型ＡＣＣ，ＴＮＭ早期和无转移者，Ⅳ型胶原多阳性表达，Ⅳ型胶原酶多阴性表达；而实体型ＡＣＣ，ＴＮＭ晚期和转移者，Ⅳ型胶原多阴性表达，Ⅳ型胶原酶多阳性表达。本研究结果表明，Ⅳ型胶原低表达和Ⅳ型胶原酶的高表达可作为判定ＡＣＣ临床恶性程度的指征，是ＡＣＣ侵袭和转移的关键因素之一。

抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv(3G11)在大肠杆菌的表达及其抗肿瘤活性

目的制备抗IV型胶原酶单链抗体(scFv),用于构建小型化抗肿瘤抗体靶向药物。方法构建重组表达质粒pET-scFv,并在大肠杆菌进行诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot法对表达蛋白进行鉴定,分步透析复性。ELISA法、免疫细胞化学染色法检测scFv对靶抗原和肿瘤细胞的结合活性,明胶酶谱法检测对IV型胶原酶活性的抑制作用。Boyden Chamber法测定对肿瘤细胞侵袭的影响。动物试验肿瘤模型检测在小鼠体内的抗肿瘤活性。结果表达的单链抗体scFv(3G11)以包涵体的形式存在,经变性和复性后,对抗原IV型胶原酶和肿瘤细胞的免疫反应呈阳性,抗体亲和常数为6×107/mol/L。不仅可以抑制HT-29细胞和HT-1080细胞分泌的Ⅳ型胶原酶活性,还可以体外抑制肿瘤细胞的侵袭,抑制程度与浓度呈剂量依赖关系。scFv(3G11)4mg/kg对小鼠移植性肝癌H22的抑瘤率为49.4%(P<0.01)。结论scFv(3G11)保留了完整抗体的抗原结合和抑制活性,能够与肿瘤细胞特异性结合,并在小鼠体内有中度抑瘤效果。scFv(3G11)的相对分子质量远小于完整抗体,可作为肿瘤靶向药物的理想载体。

胰酶和Ⅳ型胶原酶在人胚胎干细胞传代中的作用特点

目的对比人胚胎干细胞(hESC)培养过程中不同的酶消化细胞的特点,探讨适合hESC长期体外培养的消化传代方法。方法将正常生长在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)滋养层上的hESC分别用0.05%胰酶-EDTA和Ⅳ型胶原酶消化,重新接种,了解两种酶消化后的细胞存活率、克隆形成数量、细胞产量、冻存-复苏后细胞的存活率以及长期传代后细胞核型情况。结果用0.05%胰酶-EDTA消化传代后形成的克隆大小均一,每代第3d可获得碱性磷酸酶(AP)阳性克隆数(21.2±3.5)个/10倍视野,每次传代时hES细胞产量可达(4.56±1.29)×105/cm2,传代时细胞存活率高达95.60%,经冻存-复苏后也有81.20%细胞存活率。用Ⅳ型胶原酶消化组每代仅可获得低浓度胰酶消化组AP阳性克隆数的一半,克隆大小不均,细胞产量也比低浓度胰酶消化组少,传代时细胞存活率和复苏后细胞存活率和低浓度胰酶组相似。分别用两种酶处理传代十余代,核型均无异常。结论两种酶消化均适用于hESC培养,二者作用特点不完全相同,分别适用于不同的实验需要。

抗Ⅳ型胶原酶抗体Fv片段与力达霉素融合蛋白的免疫活性

目的融合蛋白Fv-LDP是通过基因工程方法制备,其抗体部分为抗Ⅳ型胶原酶抗体3G11的单链抗体scFv,相当于"弹头"的载体部分为力达霉素辅基蛋白LDP。本实验研究了融合蛋白Fv-LDP的免疫学活性。方法采用间接ELISA方法和免疫细胞荧光方法检测融合蛋白Fv-LDP的免疫学活性,明胶酶谱实验观察融合蛋白Fv-LDP对肿瘤细胞分泌明胶酶的影响,重组基膜侵袭实验分析融合蛋白Fv-LDP对肿瘤细胞侵袭能力的影响,通过制备兔抗Fv-LDP多抗,应用免疫组织化学技术检测融合蛋白Fv-LDP与人乳腺癌组织的免疫反应性。结果融合蛋白Fv-LDP与Ⅳ型胶原酶、纤维肉瘤HT-1080细胞、结肠癌HT-29细胞、肺癌PG细胞等均具有免疫反应性,3种细胞中以HT-1080细胞的相对亲和力最高,其次是PG细胞,HT-29细胞。免疫细胞荧光结果显示,肿瘤细胞HT-1080胞质着绿色荧光,表明融合蛋白Fv-LDP结合于肿瘤细胞的胞质部位。融合蛋白Fv-LDP可有效抑制肿瘤细胞分泌明胶酶,可明显抑制肿瘤细胞对人工基膜的侵袭,并呈剂量依赖性。人乳腺癌组织免疫组化结果显示,融合蛋白Fv-LDP与乳腺癌癌细胞胞质部位结合,阳性着色部位与MMP-9抗体的染色一致。结论融合蛋白Fv-LDP基本保留了完整单抗3G11对明胶酶的免疫活性,又因其携带有"弹头"的载体蛋白LDP,可以用烯二炔发色团进行强化,因此,有可能用于制备抗肿瘤抗体药物。

抗Ⅳ型胶原酶单链抗体的表达及其对肿瘤细胞侵袭的抑制作用

目的:制备抑制肿瘤细胞侵袭转移的单链抗体片段,用于构建小型化的免疫偶联物。方法:应用噬菌体呈现技术,以产生抗Ⅳ型胶原酶单抗的杂交瘤细胞为基础克隆构建单链抗体(scFv)基因。以表达质粒pET30a+为载体在大肠杆菌中进行诱导表达。ELISA法测定表达产物的免疫反应性,明胶酶谱法测定表达产物对靶酶活性的影响。BoydenChamber测定表达产物对肿瘤细胞侵袭的影响。结果:表达的单链抗体以包涵体形式存在,经变性和复性后,检测表明表达产物保留了对抗原的免疫反应性,对高转移性人肺癌PG细胞分泌的Ⅳ型胶原酶有抑制作用。同时在体外能抑制肿瘤细胞的侵袭,抑制率与表达产物的剂量浓度相关,1mg/ml浓度的片段具有68%的抑制率。结论:运用基因工程手段获得的单链抗体片段保留了亲本抗体的若干特性,对Ⅳ型胶原酶有抑制作用,并能抑制肿瘤细胞的侵袭。

人脑胶质瘤Ⅳ型胶原酶的表达

目的 研究 型胶原酶的表达与人脑胶质瘤恶性生物学行为的关系 .方法 采用明胶酶谱分析法对 41例人脑胶质瘤和 5例脑组织中 型胶原酶的含量进行检测 .结果 型胶原酶的含量随胶质瘤的恶性进展而增加 ,在正常脑组织与 , 级胶质瘤间其含量无显著性差异 (P>0 .0 5 ) ,而在 , 级与 级及 级与 级胶质瘤间其含量均有显著性差异 (P<0 .0 1) .结论 型胶原酶的过表达可能与胶质瘤的恶性发展有关 。

抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv (3G11)联合顺铂的抗肿瘤活性

目的研究抗Ⅳ胶原酶基因工程单链抗体scFv (3G11)联合顺铂的抗肿瘤效果。方法明胶酶谱法、Western-blot法研究顺铂对肿瘤细胞分泌Ⅳ胶原酶蛋白的影响,MTT法、实验动物肿瘤模型研究scFv (3G11)与顺铂联合在体外和体内试验中的抗肿瘤效果。结果顺铂可抑制肿瘤细胞分泌的Ⅳ胶原酶活性,scFv (3G11)与顺铂联合在体外试验中可抑制人肝癌BEL-7402细胞的生长,体内试验中对小鼠移植性肝癌H22有显著的抑制作用,药物相互作用指数(CDI值)<1。结论scFv (3G11)和顺铂联合应用对肝癌的治疗有协同作用。

胃癌浸润转移——整合蛋白、Ⅳ型胶原酶及细胞外基质的作用

用免疫组织化学方法研究76例胃癌标本中整合蛋白α6亚基、层粘连蛋白(Ln)、Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)及Ⅳ型胶原酶(Col Ⅳ酶)及ras P21的表达以探索胃癌浸润转移的机制,结果发现:α6及Col Ⅳ酶在胃癌细胞的表达增强,α6与Ln在基底膜上呈协调表达,而Col Ⅳ酶与Col Ⅳ在基底膜上的表达呈反比。提示α6(代表Ln受体)及其配体(Ln)通过细胞—细胞外基质的相互作用影响胃癌的浸润性生长;而Col Ⅳ酶通过分解Gol Ⅳ而促进胃癌浸润转移。且与ras P21的表达呈正相关,可能是ras癌基因活化而参与调控胃癌浸润转移表型的途径之一。它们可作为反映浸润转移性状的标志。

抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其F(ab′)_2与Fab′片段的抗肿瘤作用

目的研究抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其F(ab′)2、Fab′片段对小鼠肝癌22(H22)及小鼠Lewis癌肺转移的治疗作用。方法ELISA实验检测3G11及其片段与多种肿瘤细胞及Ⅳ型胶原酶的免疫反应性,明胶酶谱法测定其对HT-1080细胞分泌Ⅳ型胶原酶活性的影响,MTT法测定其对H22细胞的细胞毒作用。用小鼠肝癌22及小鼠Lewis肺癌模型评价单抗3G11及其片段抑制肿瘤生长及抗肿瘤转移活性。结果单抗3G11及其片段对多种肿瘤细胞及Ⅳ型胶原酶均呈阳性反应,单抗3G11抑制肿瘤细胞HT-1080分泌Ⅳ型胶原酶的活性。单抗3G11对H22细胞有微弱的细胞毒作用。单抗3G1130mg/kg对小鼠移植性肝癌的抑制率为51·8%,F(ab′)210mg/kg为49·9%,Fab′20mg/kg为39·3%。F(ab′)2片段10mg/kg对小鼠Lewis癌肺转移的抑制率为76%。结论抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其片段对小鼠移植性肝癌22生长以及对小鼠Lewis癌肺转移有中度抑制作用,可能用于研制抗体靶向药物。

强力霉素对腹主动脉瘤Ⅳ型胶原酶活性的影响

目的 :研究 型胶原酶抑制剂强力霉素对实验性腹主动脉瘤 ( abdom inal aortic aneurysm,AAA)的影响。方法 :48只 Wistar大鼠腹主动脉被胰弹力酶 15 u灌注 ,用强力霉素后 ,测量灌注前后和处死时动脉直径。标本进行 HE、弹力纤维 VG染色和明胶酶谱分析。结果 :强力霉素组 7d和 14d直径较盐水组明显减小 ,无 1例形成AAA,盐水组 7d、14d均形成 AAA。虽然两组均有炎性浸润 ,但强力霉素组较盐水组有效预防弹力纤维破坏。 92KD 型胶原酶在盐水组明显增高 ,而强力霉素组较低。结论 :强力霉素限制 AAA形成和扩张 ,其机制是直接抑制92 KD 型胶原酶或抑制炎性细胞产生 92 KD 型胶原酶 ,而不是抑制炎症反应。

TIMP-2基因转染在裸鼠胃癌中Ⅳ型胶原酶及Ⅳ型胶原改变的研究

目的：探讨组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP－2）基因体外转染胃癌SGC－7901细胞系后建立的裸鼠侵袭模型中的Ⅳ型胶原和Ⅳ型胶原酶改变的情况。方法：用TIMP－2基因体外转染的胃癌SGC－7901细胞系建立裸鼠肿瘤侵袭模型，并应用免疫组化对侵袭部位的组织Ⅳ型胶原和Ⅳ型胶原酶前体（MT－MMP）的改变作了研究。结果：正常肾脏组织Ⅳ型胶原酶反应阳性率与在种植肿瘤中阳性率两者差异显著（P＜0．01）。Ⅳ型胶原染色显示，肾小管及肾小球基底膜完整呈连续性线状分布，肿瘤部位的Ⅳ型胶原在基底膜处出现断裂和缺失，而肿瘤浸润部见Ⅳ型胶原酶表达异常丰富。结论：组织金属蛋白酶抑制剂TIMP－2基因转染参与肿瘤细胞分泌胶原酶的调控过程，抑制了Ⅳ型胶原的降解，是肿瘤侵袭、转移的重要负作用因子。

人大肠癌转移与Ⅳ型胶原酶的关系

目的 :探讨人大肠癌转移与Ⅳ型胶原酶的关系。 方法 :应用明胶酶谱分析法检测了 31例大肠癌组织Ⅳ型胶原酶的活性 ,并用RT PCR方法检测了 92KDⅣ型胶原酶RNA的表达情况。 结果 :在伴有转移的大肠癌标本中 ,Ⅳ型胶原酶的活性形式与非活性形式表达均较高 ,92KDⅣ型胶原酶的mRNA在转移癌中高表达。 结论

人大肠癌转移与Ⅳ型胶原酶的关系

目的 探讨人大肠癌转移与Ⅳ型胶原酶的关系。方法 应用明胶酶谱分析法 (Zymography)检测了 31例大肠癌组织Ⅳ型胶原酶的活性 ,并用RT PCR方法检测 92kDⅣ型胶原酶RNA的表达情况。结果 在伴有转移的大肠癌标本中 ,Ⅳ型胶原酶的活性形式与非活性形式表达均较高 ,92kDⅣ型胶原酶的mRNA与在转移癌中高表达。结论 Ⅳ型胶原酶与大肠癌的转移密切相关。

Ⅳ型胶原酶模型的建立及其在中药活性成分筛选中的应用

目的建立Ⅳ型胶原酶筛选模型,并运用此模型对中药活性成分进行评价。方法利用Ⅳ型胶原酶特异性水解明胶释放的末端氨基与2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)发生显色,吸光度值可以衡量Ⅳ型胶原酶含量,优化Ⅳ型胶原酶浓度、琥珀酰凝胶浓度、显色剂用量及时间参数。结果确定了Ⅳ型胶原酶筛选模型的条件:5.0×10^(-5) g/L酶溶液、20 g/L琥珀酰凝胶溶液、60μl 0.05%TNBS、显色30 min,阳性药盐酸四环素在1.0 g/L下对该酶的抑制率是19.39%,并呈现一定的量效关系,表明成功建立该筛选模型。应用该模型筛选发现,阿魏酸和川芎嗪具有明显的抑制Ⅳ型胶原酶活性,而水杨酸和小檗碱则具有促进作用。结论Ⅳ型胶原酶的筛选模型成功建立并应用到中药活性成分筛选中,为快速评价中药活性成分及其作用机制提供了有益参考。

可溶性CD44v6和Ⅳ型胶原酶在恶性腹水中的诊断价值

目的:检测恶性腹水可溶性CD44v6(sCD44v6)、Ⅳ型胶原酶,为临床恶性腹水诊断提供依据。方法:收集各种类型腹水,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)的方法检测sCD44v6含量,用明胶酶谱法检测Ⅳ型胶原酶活性。结果:恶性腹水sCD44v6水平为(89.22±38.20)ng·ml-1,明显高于肝硬化、结核性腹水(P均<0.01),而后二者间比较sCD44v6水平差别无显著性(P>0.05)。肝硬化、结核性腹水不能检出基质金属蛋白酶-2,-9(MMP-2,-9),而恶性腹水MMP-2检出率为87.0%,MMP-9检出率为78.3%,且MMP-2活性高于MMP-9活性(P=0.022)。结论:恶性腹水sCD44v6显著升高且Ⅳ型胶原酶阳性。sCD44v6、Ⅳ型胶原酶对良、恶性腹水的鉴别诊断有重要价值。

抗IV型胶原酶单抗与平阳霉素新型免疫偶联物的抗肿瘤作用

目的考察抗IV型胶原酶单抗3G11与平阳霉素(PYM)偶联物的抗肿瘤作用。方法采用多聚谷氨酸(PLG)为中间载体制备3G11-PLG-PYM偶联物,MTT法测定其对肿瘤细胞增殖的抑制作用,以小鼠移植性肝癌H22为模型观察体内抗肿瘤作用。结果偶联物保留了单抗3G11对IV型胶原酶的免疫活性,对体外培养H22和KB细胞的杀伤作用弱于PYM。动物实验中PYM10mg·kg-1对H22肝癌的抑制率为60·6%,而等细胞毒性剂量的3G11-PLG-PYM偶联物抑瘤率达到90·8%,与PYM相比可显著延长小鼠的中位生存时间。结论3G11-PLG-PYM偶联物对小鼠肝癌H22的抑瘤作用比PYM强,可能成为新型的抗肿瘤靶向药物。

不同力达霉素与抗VI型胶原酶单抗偶联物的抗肿瘤作用

研究不同偶联方法制备的力达霉素(LDM)与抗IV型胶原酶单抗3G11免疫偶联物的选择性抗肿瘤作用。采用SPDP和SMBS作为偶联剂,将LDM辅基蛋白69位赖氨酸与2-亚氨基四氢噻吩修饰的单抗3G11连接,制备免疫偶联物;ELISA法测定偶联物的免疫活性,克隆形成法及人HT-1080细胞免疫缺陷小鼠移植模型观察两种偶联物的抗肿瘤作用。偶联物保留了单抗3G11对IV型胶原酶的免疫活性,3G11-SMBS-LDM对体外培养的HT-1080细胞的杀伤作用强于LDM和3G11-SPDP-LDM。动物实验显示,LDM在等摩尔剂量条件下3G11-SMBS-LDM的抑瘤率为86.1%,游离的LDM组为71.2%,3G11-SPDP-LDM组为77.1%,3G11-SMBS-LDM的抑制作用显著增强。3G11-SMBS-LDM组动物的平均生存时间延长为163.7%,3G11-SPDP-LDM组为125.3%,LDM组为71.9%,3G11-SMBS-LDM能显著延长荷瘤鼠的生存期,两个偶联物之间有显著性差异。3G11-SMBS-LDM偶联物更具有选择性抗肿瘤作用,疗效显著提高,荷瘤动物生存期延长,毒性明显降低,可能成为新的肿瘤治疗药物。