Advances in Transgenic Techniques in Apple

Main progress of transgenic techniques in apple made in recent years was summarized, and related research achievements in various aspects like transformation method, regenerating ability of explants, strain type and infection conditions of Agrobacterium were reviewed. On this basis, the current bottlenecks in transgenic techniques in apple were put forward.

根癌农杆菌介导苹果遗传转化研究进展

论述和分析了影响苹果高效离体再生的主要因素 ,包括试验材料苹果的基因型、外植体生理状态、培养基类型、植物激素、Ag NO3、前期暗培养、抗生素等内外因子 ,以及影响根癌农杆菌介导苹果遗传转化的主要因素 ,包括苹果基因型、外植体生理状态、菌株类型、菌液浓度、活化物质的应用、共培养、预培养、选择培养、培养基成分等内外因子。并对其研究现状。

根癌农杆菌介导寒富苹果转化体系的建立

以寒富苹果组培苗叶片为外植体,利用植物表达载体上含潮霉素抗性基因的根癌农杆菌EHA105(pCAMBI-A1301)和含卡那霉素抗性基因的根癌农杆菌EHA105(pCAMBIA2301)对影响寒富遗传转化效率的因素进行系统研究。结果表明,寒富叶片对潮霉素反应敏感,在附加潮霉素的培养基上寒富叶片褐化较为严重。潮霉素和卡那霉素适宜的筛选质量浓度分别为4 mg.L-1和25 mg.L-1。农杆菌介导寒富苹果转化体系的建立以MS+TDZ 2.0 mg.L-1+NAA 0.5 mg.L-1培养基为叶片离体再生芽培养基。适宜的转化条件为:菌液浓度D 600nm=0.5、叶片外植体在菌液浸泡8 min、共培养时间为3～4 d、推迟4 d进行筛选培养。抗性基因对转化效率具有明显的影响,EHA105(pCAMBIA2301)的平均抗性芽再生率(0.96%)比EHA105(pCAMBIA1301)的平均抗性芽再生率(0.58%)高出几乎50%,EHA105(pCAMBIA2301)的抗性芽再生率最高达1.87%。GUS组织化学染色和PCR鉴定结果表明本研究获得了寒富苹果转基因植株。

农杆菌介导法将LFY基因导入苹果的研究

以M26苹果叶片为外植体,利用GUS瞬时表达率,对农杆菌介导法转化苹果的因素进行优化,通过含LFY基因的根癌农杆菌EHA105转化苹果叶片,获得了提早开花的转基因植株.结果表明：以OD600=0.3～0.5农杆菌菌液侵染叶片,25℃条件下共培养,共培养后的叶片延迟筛选3 d,在附加卡那霉素30 mg/L的再生培养基中选择培养,转化芽再生率可达6.97%.PCR检测初步证明目的LFY基因已整合到苹果基因组中.

苹果遗传转化的研究进展

苹果的遗传转化技术通过分子手段改良苹果 ,有助于缩短其育种周期。最近十年 ,在该领域的研究取得很大进展 ,涉及到一些重要的苹果基因型及有用的外源基因。迄今 ,苹果的遗传转化主要采用农杆菌介导法 ,侵染与转化材料的再生是影响其转化效率的关键过程 ,了解其影响因素 ,寻找有利因素以提高转化效率是目前苹果遗传转化研究的重点。

根癌农杆菌介导的甜瓜遗传转化

以甜瓜子叶为根癌农杆菌介导转化的受体,通过GUS基因瞬间表达率的分析,研究影响转化体系的重要试验参数。试验结果表明,甜瓜对卡那霉素耐性高,筛选浓度可高达150 mg/L,Ag+能促进转化率,而AS不能促进转化率。前期的消毒效果与季节有很大的关系,不同季节选择不同的消毒方式更能节约种质资源。

根癌农杆菌介导的苹果遗传转化研究进展

自1986年首次获得苹果转基因植株以来,苹果遗传转化的研究发展极为迅速,用于苹果遗传转化研究的基因型也越来越多。在苹果上进行遗传改良的主要方法是农杆菌介导的遗传转化法。从农杆菌介导的转化过程入手,探讨了农杆菌菌株类型、农杆菌Vir基因诱导物的加入、受体材料的生理状态等方面综述了影响农杆菌转化苹果的各个因素,指出今后的研究重点应放在新的转化方法的提出及进一步提高转化效率的研究上。

农杆菌介导的地被菊遗传转化体系的优化

本研究以地被菊‘北林黄’无菌苗叶片外植体为受体材料,以卡那霉素抗性基因为选择标记基因,对农杆菌介导的地被菊‘北林黄’的遗传转化体系进行优化。研究结果表明:选取植株中部叶片为转化受体,外植体在经过1d的预培养,用活化的OD600为0.6的农杆菌侵染10min,共培养2d,再经过3d延迟培养后转移到筛选培养基上培养,有利于提高遗传转化效率,外植体的愈伤组织获得数和抗性芽数均最高。在筛选后期,不定芽生根阶段使用的Kanamycin(Kan)选择压力为25mg/L。获得的部分Kan抗性植株经PCR检测,扩增出特异条带,初步证明目的基因已整合到‘北林黄’基因组DNA中。本研究将为进一步利用分子手段对地被菊进行遗传改良,并获得综合抗逆性提高的优异种质奠定基础。

农杆菌介导柱型苹果“鲁加6号”遗传转化体系的建立

本研究以柱型苹果"鲁加6号"试管苗叶片外植体为转化材料,以卡那霉素抗性基因为选择标记,建立了根癌农杆菌介导的柱型苹果"鲁加6号"苹果的遗传转化体系。研究结果表明:在MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.05mg/L培养基上,叶片不定芽分化阶段Km的选择压力为20mg/L,不定芽生根阶段Km的选择压力为15mg/L,脱菌培养阶段头孢霉素的适宜浓度为300mg/L。在农杆菌介导的遗传转化过程中,外植体经过36h预培养,侵染10min,共培养48h时,有利于提高遗传转化效率,获得的抗性愈伤组织和抗性芽数均最高。获得的Km抗性植株经PCR检测,扩增出特异条带,初步证明目的基因已整合到苹果基因组DNA中。

农杆菌介导法将LFY基因导入嘎拉苹果的研究

以嘎拉苹果叶片为外植体，利用GUS瞬时表达率，对农杆菌介导法转化苹果的因素进行优化。结果表明：卡那霉素（Km）选择压在30mg／L时，外植体预培养2—3d后以OD600=0．3～0．5农杆菌菌液浸泡3～5min共培养3d，延迟筛选3d可明显提高M26叶片转化效率，GUS阳性率达50％。PCR检测初步证明，LFY基因已整合到苹果再生植株中。

农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系的优化

[目的]探讨魔芋愈伤组织培养基、不同转化条件(菌液浓度、侵染时间、预培养时间及共培养时间)及转化植株的筛选条件(抗生素浓度和乙酰丁香酮(AS)浓度)等因素对转化效率的影响。[方法]采用卡那霉素抗性基因为选择标记,对农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系进行优化。[结果]在预培养2 d,用OD600为0.6的菌液侵染30 min、共培养3 d,卡那霉素100 mg/L,羧苄青霉素250 mg/L,AS浓度100μmol/L的条件下能有效提高转化效率。再生花魔芋植株经GUS染色及PCR检测,结果表明外源目的基因已经整合到花魔芋基因组中。[结论]为魔芋抗病品种的转基因培育,丰富其种质资源,寻找抗病新途径提供理论依据和试验基础。

乙醇酸氧化酶基因植物表达载体构建及转化苹果的研究

为了研究GO基因在植物中的功能,获得转基因植株,用限制性内切酶将乙醇酸氧化酶(GO)基因从克隆载体pBSSP5上切下,连接到植物双元表达载体pBin117的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,成功构建了GO基因植物表达载体pBinGO。在此基础上以嘎拉苹果叶片为受体,通过根癌农杆菌介导法将GO基因导入苹果,获得了2个抗性芽,PCR检测初步表明GO基因已整合到嘎拉苹果基因组中。

农杆菌介导的Vf基因转化柱型苹果的研究

以柱型苹果“鲁加6号”为试材,研究了根癌农杆菌介导的Vf基因转化条件。研究结果表明,该转化的优化条件为:共培养时间为3 d;延迟培养阶段头孢霉素浓度为200 mg/L,时间为6 d;选择培养阶段,芽分化过程卡那霉素浓度为15 mg/L,生根过程卡那霉素浓度为10 mg/L。PCR检测结果初步表明,外源Vf基因已导入转化植株基因组中。

抗坏血酸过氧化物酶基因转化苹果的研究

利用根癌农杆菌介导法对"嘎啦"苹果叶片进行遗传转化,获得"嘎啦"苹果的转基因植株。2d的预培养,OD600值约为0.6的工程菌液浓度,侵染时间10min,3d的共培养,延迟筛选10d获得较高的转化效率。PCR检测和Gus染色表明,APX基因已整合到苹果基因组中。

农杆菌介导FT基因转化嘎拉苹果的研究

用农杆菌介导法对苹果品种嘎拉转化FT基因进行了研究,建立了苹果离体叶片高效再生体系,在含BA 5mg/L+IAA 0.5 mg/L的MS培养基上,以离体叶片远轴面(叶背面)向上,经过14 d的暗培养获得再生不定芽和再生植株,再生率达97%。在转基因再生体系中,以头孢噻肟钠500 mg/L和卡那霉素5 mg/L,作为脱菌培养和选择培养的条件,经过感染携带拟南芥FT基因的农杆菌,获得了一批转FT基因的植株,经PCR检测,目的基因已经整合到苹果基因组中。

根癌农杆菌介导苹果愈伤组织遗传转化体系的优化

【目的】以‘王林’苹果愈伤组织为转化研究的材料,在已经建立的遗传转化基础上,优化根癌农杆菌介导的‘王林’愈伤组织的遗传转化系统。【方法】在遗传转化的过程中,通过对根癌农杆菌的侵染时间、共培养以及抗性的选择,优化遗传转化体系并且增加转化效率。【结果】选择生长20 d的愈伤组织,在根癌农杆菌OD 600=0.8时侵染20 min,共培养3 d、转入卡那霉素30 mg/L和头孢噻肟250 mg/L的培养基上进行筛选,可显著提高遗传转化效率。【结论】将McmiR399d作为标记基因进行转化,优化苹果‘王林’愈伤组织的遗传转化系统,从而得到过表达和沉默的McmiR399d‘王林’愈伤组织。