复方苦芩对细小病毒感染犬血液T细胞亚群和细胞因子的影响

研究复方苦芩对细小病毒感染犬T细胞亚群和细胞因子的影响。建立犬细小病毒感染模型,把动物随机分为6个组,分别为空白对照组,模型组,阳性药物组,复方苦芩高、中、低剂量组,每组20只。将攻毒后6h设定为试验0d,分别于试验0、7、14、21、28、35d采血,流式细胞术检测T淋巴细胞亚群,试剂盒检测IL-2、IL-4、IFN-γ含量。结果显示:与模型组相比,复方苦芩可促进犬机体分泌IL-2、IL-4和IFN-γ,提高外周血CD3+T、CD3+CD4+T细胞百分数,降低CD3+CD8+T细胞百分数。复方苦芩能够调节细小病毒感染犬的免疫机能,提高犬抗病毒能力。

复方苦芩对感染猪传染性胃肠炎病毒的PK-15细胞中Bcl-2/BAXmRNA转录的影响

【目的】探讨中药复方苦芩对感染猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)的猪肾细胞(PK-15)中凋亡基因Bcl-2/BAX mRNA转录的影响。【方法】体外扩增TGEV,用TGEV感染PK-15细胞的模型进行体外试验研究,试验中设有复方苦芩组、空白组、模型组及黄芪多糖组,在测定了病毒半数感染细胞量(TCID50),复方苦芩及黄芪多糖药液对PK-15细胞的最大无毒浓度后,制作细胞爬片采用瑞士染色法染色观察PK-15细胞的形态变化;按试剂盒操作提取各试验组RNA并及时反转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR法检测细胞中Bcl-2和BAX mRNA转录情况。【结果】与空白组相比,模型组的PK-15细胞发生了明显的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),细胞变细长,细胞间成网状,细胞核着色较浅,出现核浓缩、固缩、碎裂等现象;与模型组比,复方苦芩组与黄芪多糖组细胞病变得到改善,而复方苦芩组效果更加明显,大部分细胞核结构清晰,染色质着色均一,少部分细胞核变大或碎裂;与空白组相比,模型组Bcl-2 mRNA转录量减少(P<0.01),复方苦芩组Bcl-2基因转录量增加,为模型组的1.403倍(P<0.01)、黄芪多糖组的1.078倍(P>0.05);与空白组相比,模型组BAX mRNA转录量明显升高,而其他3组BAX基因转录差异不明显(P>0.05),模型组BAX基因转录量为空白组的1.440倍、复方苦芩组1.290倍、黄芪多糖组的1.490倍,差异极显著(P<0.01),复方苦芩组、黄芪多糖组BAX基因转录量分别为空白组的1.116倍、0.966倍,差异不显著(P>0.05);与空白组相比,模型组Bcl-2/BAX mRNA转录比值降低,差异极显著(P<0.01);与模型组相比,复方苦芩组、黄芪多糖组Bcl-2/BAX mRNA转录比值均增加,分别为模型组1.809倍和1.940倍,差异极显著(P<0.01),复方苦芩组Bcl-2/BAX mRNA转录比值分别为空白组的0.749倍(P<0.01)、黄芪多糖组的0.933倍(P>0.05)。【结论】复方苦芩可通过上调PK-15细胞Bcl-2 mRNA转录,下调BAX mRNA的转录,从而抑制TGEV引起的PK-15细胞凋亡。

复方苦芩总多糖体外抗犬细小病毒作用机理研究

为探讨复方苦芩总多糖体外抗犬细小病毒(CPV)感染F81细胞作用机制,以F81细胞为宿主细胞,复方苦芩和黄芪多糖作药物对照,从复方苦芩总多糖对CPV的直接灭活作用、阻滞作用、抑制吸附、穿入及其复制5个方面探讨复方苦芩总多糖抗CPV活性机理。结果显示,复方苦芩总多糖在CPV病毒复制过程中均有一定的抑制作用,其中直接灭活作用效果优于复方苦芩组,P<0.05,复制试验效果优于复方苦芩组,P<0.05,与阳性药物组差异不显著,P>0.05。从而表明复方苦芩总多糖体外抗CPV感染F81细胞效果明显,且主要通过直接灭活CPV和抑制其复制而发挥作用。

复方苦芩总生物碱保护F81细胞免受犬细小病毒损伤作用的探究

为了探讨中药复方苦芩总生物碱(Total Alkaloids in Kuqin Compound,TAKC)保护F81细胞免受犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)损伤的作用机理,用CPV感染F81细胞,选择不同浓度的TAKC进行体外抗CPV感染F81细胞试验,采用琥珀酸脱氢酶活力测定法检测TAKC对F81细胞的保护率,用RT-PCR法检测TAKC处理对感染CPV的F81细胞中caspase-3基因mRNA表达水平的影响.结果显示,TAKC对F81细胞有保护作用,其在整个病毒复制过程中(直接灭活作用、阻滞作用、吸附抑制作用、穿入抑制作用和复制抑制作用)均有明显的影响,其中阻滞作用、穿入抑制作用和复制抑制作用效果最明显,对细胞的保护率分别能达到31.19%,20.54%,32.28%.同时使感染CPV的F81细胞的caspase-3基因表达水平显著降低(p<0.01),表达水平与模型组的比值为1∶1.818.因此,推测TAKC可通过阻滞抑制、穿入抑制和DNA复制抑制CPV感染F81细胞和降低F81细胞中caspase-3基因表达水平,起到保护F81细胞免受CPV损伤的作用.

苦芩总多糖对免疫低下小鼠免疫功能的影响

为了探索苦芩总多糖对免疫低下小鼠免疫功能的影响,试验通过对苦芩中总多糖的提取,并将所提取总多糖对免疫低下小鼠进行一系列免疫相关试验,如碳粒廓清指数测定试验、免疫器官指数测定试验、淋巴细胞转化试验、血清溶血素的测定试验。结果表明,苦芩及其总多糖均能显著提高免疫抑制小鼠的吞噬指数α,脾脏指数和胸腺指数,同时还能显著提高免疫抑制小鼠血清溶血素水平以及T、B淋巴细胞转化率。表明苦芩总多糖可以通过调节机体的免疫系统从而增强机体的免疫功能。

复方苦芩总黄酮对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

为了观察复方苦芩总黄酮对免疫抑制小鼠的免疫增强作用,用环磷酰胺构建小鼠免疫抑制模型,给免疫抑制小鼠灌服复方苦芩总黄酮,检测碳粒廓清指数,脾脏指数,胸腺指数,血清溶血素水平及T,B淋巴细胞转化率.结果显示:复方苦芩总黄酮能够提高免疫抑制小鼠的碳粒廓清指数、脾脏指数、胸腺指数,同时也能够提高小鼠血清溶血素水平和增强T,B淋巴细胞转化率,与模型组比较差异极具有统计学意义(p<0.01),且高剂量和中剂量组效果优于低剂量组,差异具有统计学意义(p<0.05)或者极具有统计学意义(p<0.01).表明复方苦芩总黄酮能增强机体的免疫功能.

复方苦芩软膏质量标准研究

目的:对复方苦芩软膏的质量标准进行研究。方法:采用薄层色谱法对方中芦荟苷、黄芩苷、薄荷脑进行定性鉴别;采用高效液相色谱法测定制剂中黄芩苷及延胡索乙素的含量。结果:定性鉴别方法专属性强。延胡索乙素的线性范围为0.131～3.275μg(r=0.9999),平均回收率为102.40%,RSD=0.77%(n=6);黄芩苷的线性范围为0.05035～2.014μg(r=0.9999),平均回收率为100.97%,RSD=1.42%(n=6)。结论:本方法简便、准确,重复性好,可用于复方苦芩软膏的质量控制。

复方苦芩对小鼠免疫功能及犬IL-4 mRNA和IFN-γ mRNA表达的影响

为了探讨复方苦芩对免疫低下小鼠免疫功能和对犬细胞因子IL-4mRNA、IFN-γmRNA表达的影响,将120只小鼠随机分为空白对照组、模型组(环磷酰胺造免疫低下小鼠模型,不给药)、阳性药物对照组(黄芪多糖注射液)、复方苦芩制剂高、中、低剂量组,连续给药7d,给药后,除空白对照组外,各组腹腔注射环磷酰胺0.2mL(80mg/kg)制造免疫低下模型,1次/d,共3d。于末次给药后第1小时,测定碳粒廓清指数、脾指数、胸腺脏器指数及T、B淋巴细胞转化率;建立犬细小病毒模型,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法观察复方苦芩对犬细胞因子IL-4mRNA、IFN-γmRNA表达的影响。结果显示,复方苦芩能增加小鼠脾指数和胸腺指数,明显增加T、B淋巴细胞的转化率和碳清值,降低犬细小病毒引起的犬血清细胞因子IL-4含量及其mRNA表达的增加,升高犬细小病毒引起的犬血清IFN-γ含量及其mRNA表达的降低。结果表明,复方苦芩具有增强小鼠非特异性免疫功能,降低犬血清细胞因子IL-4含量及其mRNA的表达,升高犬血清IFN-γ含量及其mRNA的表达的作用。

复方苦芩对犬细小病毒致肠黏膜细胞凋亡及相关基因表达的影响

将犬分为空白对照组、模型组、复方苦芩预防组、复方苦芩治疗组,用犬细小病毒接种建立动物模型,复方苦芩防治犬细小病毒病,然后取样,光学显微镜和电子显微镜观察十二指肠黏膜细胞的病变和细胞凋亡,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测Bcl-2和Bax基因的mRNA表达。结果显示,与空白对照组比较,模型组犬十二指肠黏膜病变及炎细胞浸润,电镜下可见细胞收缩,核浓缩,深染,线粒体肿胀空化,细胞Bcl-2基因表达下调,Bax基因表达增加。与模型组相比,复方苦芩防治组肠黏膜病变轻,超微结构变化不明显,细胞Bax基因表达下调,Bcl-2基因表达上调。结果表明,复方苦芩可能是通过促进黏膜上皮细胞的增殖与恢复,调节Bcl-2,Bax基因表达,抑制犬细小病毒引起的十二指肠黏膜超微结构改变和细胞凋亡,而对细小病毒病犬的十二指肠组织结构起保护和促进恢复作用。

复方苦芩有效成分对犬细小病毒病病犬小肠组织细胞凋亡及基因表达的影响

为探讨复方苦芩3种有效活性成分对人工感染肠炎型犬细小病毒病(canine parvovirus disease,CPVD)病犬小肠组织的保护作用,将50只试验犬随机分为复方苦芩总多糖组、复方苦芩总生物碱组、复方苦芩总黄酮组、空白对照组和模型组。其中,试验药物组均按1.5 mL/kg肌肉注射复方苦芩3种有效成分,2次/d,连续用药7 d后灌服2 mL(5×10~5 PFU/mL)的病毒液进行人工复制病理模型,空白组肌注射生理盐水,模型组只攻毒不给药。接种病毒后经检测为阳性后3天在无菌条件下取各组犬只小肠组织,用TUNEL法检测各组小肠组织细胞的凋亡率,同时采用荧光定量PCR对各试验组小肠组织Bax和Bcl-2 mRNA转录进行相对定量检测,并运用Western blot方法检测Bcl-2和Bax蛋白表达量。结果显示,通过组织切片观察,复方苦芩3种有效活性成分可防止病毒对犬小肠细胞形态的病理作用,可降低细胞凋亡率,并且3种有效成分对小肠组织可增高小肠组织Bcl-2/Bax基因和蛋白表达量,从而减少因病毒所引起的细胞凋亡;结果表明,复方苦芩3种有效成分对CPVD病犬小肠组织均有一定的保护作用,其中复方苦芩总生物碱对CPVD病犬小肠组织细胞凋亡的预防效果最显著。

正交试验优选复方苦芩软膏基质处方

目的:优选复方苦芩软膏的基质处方。方法:以十二烷基硫酸钠、硬脂酸、月桂氮酮用量为考察因素,以涂展性、家兔皮肤刺激性的综合评分为指标,采用正交试验优选基质处方。结果:基质处方最佳配比为十二烷基硫酸钠、硬脂酸、月桂氮酮用量分别占0.27%、3.28%、1.64%。结论:以优选的基质处方制备的复方苦芩软膏对家兔皮肤无刺激性,外观良好,有适当黏稠性,易于涂展。

复方苦芩结合针灸治疗犬细小病毒病及对犬肠黏膜的修复作用

将40~60日龄中华田园犬随机分为空白组、模型组、阳性药物组、复方苦芩组、针灸组和复方苦芩结合针灸组,每组30只;除空白组外,其余各组犬按照5 mL/kg(5×105 PFU/mL)灌服犬细小病毒液建立细小病毒病犬模型。复方苦芩组、针灸组和复方苦芩结合针灸组分别采用复方苦芩注射液、针灸、复方苦芩注射液结合针灸治疗。对复方苦芩注射液进行红外光谱鉴定,采用ELISA法测定犬血清中TNF-α、IL-1、IL-2及肠黏膜中IL-4、IL-5、IFN-γ水平,并制作小肠组织病理切片。结果显示,鉴定复方苦芩注射液中含有黄酮类、生物碱类、多糖类等有效物质;小肠组织病理切片显示各治疗组犬小肠组织病变和绒毛脱落情况相对模型组有好转趋势;与空白组比,模型组病犬血清与肠黏膜中各因子水平极显著升高(P<0.01);与模型组比,复方苦芩结合针灸组犬血清中IL-1、IL-2和肠黏膜中IL-4、IL-5水平极显著降低(P<0.01),而复方苦芩结合针灸组血清中TNF-α水平显著降低(P<0.05)。结果表明,复方苦芩结合针灸治疗可降低血清和肠黏膜中的炎性因子,修复病犬肠黏膜,改善炎症。