叶下珠复方Ⅱ号对肝癌Huh7细胞白细胞介素-6信号通路与微小RNA let-7a网络的调控作用

【目的】研究叶下珠复方Ⅱ号对肝癌Huh7细胞白细胞介素-6(IL-6)信号通路与微小RNA let-7a网络失衡的调节作用。【方法】以不同浓度的叶下珠复方Ⅱ号体外作用于人肝癌Huh7细胞株,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测药物对人肝癌Huh7细胞增殖的影响。设空白对照组、叶下珠复方II号高剂量组(48.0 g/L)和低剂量组(24.0 g/L),采用放射免疫法检测药物作用后肝癌Huh7细胞分泌IL-6的变化;采用茎环结构的逆转录实时荧光定量PCR方法检测肝癌Huh7细胞MicroRNA let-7a和miR-21的表达变化,采用实时荧光定量PCR方法检测药物作用后IL-6、核因子-κB亚基P65(NF-κB/P65)、转录活化因子(STAT3)、蛋白激酶2(AKT2)、PTEN、K-ras、c-myc、Bcl-2基因的mRNA表达变化,采用Westernblot法检测PTEN、STAT3、AKT2蛋白表达的变化。【结果】肝癌Huh7细胞经叶下珠复方Ⅱ号处理48 h,高、低剂量组Huh7细胞增殖率和上清液IL-6含量均显著下降,与空白对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.01)。叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量处理后microRNA let-7a表达量显著上升、miR-21的表达显著下降,与空白对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.01);叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组与空白对照组比较,NF-κB/P65、STAT3、AKT2、K-ras、c-myc、Bcl-2基因mRNA的表达量均显著下降(P<0.01),而PTEN mRNA的表达显著增加(P<0.01),并呈明显的量效关系。叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组处理后PTEN的蛋白表达显著增加,STAT3、AKT2的蛋白表达显著减少,与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。【结论】叶下珠复方Ⅱ号对人肝癌Huh7细胞增殖有明显的抑制作用,作用机制与抑制IL-6表达和IL-6/STAT3信号通路活化,调节IL-6信号通路与MicroRNA let-7a网络的失衡作用有关。

叶下珠复方Ⅱ号对小鼠实验性肝损伤的保护作用

【目的】观察叶下珠复方Ⅱ号对小鼠实验性肝损伤的保护作用。【方法】将NIH小鼠随机分成正常对照组,模型组,叶下珠复方Ⅱ号高、中、低剂量组(剂量分别为110、55、27.5 g.kg-1),联苯双酯组(150 mg.kg-1);以刀豆蛋白A(Con A)和D-氨基半乳糖(D-GalN)分别复制小鼠急性肝损伤模型,用叶下珠复方II号水提液进行干预治疗,并与联苯双酯进行对照,检测小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及肝组织超氧化物歧化酶(SOD)活性,并观察肝组织病理改变。【结果】叶下珠复方Ⅱ号可显著性降低两种实验性肝损伤小鼠血清ALT和AST活性,升高肝损伤小鼠肝组织SOD活性,与模型组比较差异有显著性意义(P<0.01),与联苯双酯组比较差异无显著性意义(P>0.05),且可明显减轻肝组织病理改变。【结论】叶下珠复方Ⅱ号对刀豆蛋白A和D-氨基半乳糖所致小鼠实验性肝损伤具有较好的保护作用,作用机制与抑制脂质过氧化损伤有关。

叶下珠复方Ⅱ号对HSC-T6增殖及TIMP-1mRNA表达的影响

目的观察叶下珠复方Ⅱ号对肝星状细胞(HSC-T6)增殖及基质金属蛋白酶抑制因子mRNA(TIMP-1mRNA)表达的影响,探讨叶下珠复方Ⅱ号抗肝纤维化效果和作用机理。方法体外培养HSC-T6,随机分为对照组和叶下珠复方Ⅱ号5.00、2.50和1.25mg/ml组。加药后用MTT法检测各组HSC-T6增殖变化,且采用RT-PCR方法测定各组HSC-T6的TIMP-1mRNA表达。结果叶下珠复方Ⅱ号各剂量组药物对HSC-T6的增殖有明显的抑制作用,且TIMP-1mRNA表达都低于正常对照组。结论叶下珠复方Ⅱ号能抑制HSC-T6增殖和TIMP-1mRNA表达,从而减弱TIMP-1对基质金属蛋白酶的抑制作用,促进ECM的降解,这可能是叶下珠复方Ⅱ号抗肝纤维化的作用机制之一。

叶下珠复方Ⅱ号对裸鼠肝癌移植瘤生长的抑制作用及机制

目的观察叶下珠复方Ⅱ号对肝癌HepG_2细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用,并探讨其作用机制。方法建立BALB/C裸鼠肝癌HepG_2细胞皮下移植瘤模型,随机分为模型组,叶下珠复方Ⅱ号高、中、低剂量组(17.28,8.64,4.32 g·kg^(-1))和氟尿嘧啶(5-Fu)组(0.025 g·kg^(-1)),给药6周后处死裸鼠,剥离瘤组织称质量。体外观察叶下株复方Ⅱ号对HepG_2细胞增殖、集落形成、细胞周期和细胞凋亡的影响,观察药物作用后Wnt1和β-catenin基因mRNA表达的改变。结果叶下珠复方Ⅱ高、中、低剂量组对裸鼠HepG_2肝癌细胞移植瘤生长的抑制作用明显,与模型组比较,肿瘤质量均明显减轻(P<0.01),但与5-Fu组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。叶下珠复方Ⅱ号体外在10 mg·mL^(-1)以上浓度能明显抑制肝癌Hep G2细胞的增殖,呈明显的量-效关系和时-效关系;叶下珠复方Ⅱ号在2 mg·mL^(-1)以上浓度,对HepG_2细胞集落形成呈明显的抑制作用;叶下珠复方Ⅱ号以15,20 mg·mL^(-1)浓度作用HepG_2细胞48 h后,G0/G1期细胞比例明显降低,S期细胞比例显著增加,与细胞对照组比较,差异均具有统计学意义(P<0.01);叶下珠复方Ⅱ号在10,15,20 mg·mL^(-1)浓度,作用于HepG_2细胞48 h,细胞早期凋亡率和总凋亡率明显增加,与细胞对照组比较,差异均具有统计学意义(P<0.01)。叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组(20,10 mg·mL^(-1))作用于HepG_2细胞48 h后,Wnt1和β-catenin基因m RNA的表达量均明显低于细胞对照组(P<0.01,P<0.05)。结论叶下珠复方Ⅱ号对BALB/C裸鼠肝癌HepG_2细胞皮下移植瘤的生长具有明显的抑制作用,作用机制与抑制Wnt1/β-catenin基因表达和信号通路活化,从而阻滞细胞周期、抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡有关。

叶下珠复方Ⅱ号对肝癌Huh7细胞miR-122表达及IGF-1R信号通路的调控作用

目的观察叶下珠复方Ⅱ号对肝癌Huh7细胞miR-122表达及胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)信号通路的影响,探讨其抗肝癌作用机制。方法采用反义寡核苷酸技术(siRNA)建立miR-122表达抑制肝癌Huh7细胞株(anti-miR-122-Huh7细胞)。体外培养Huh7、anti-miR-122-Huh7细胞,分别设置对照组、叶下珠复方Ⅱ号高剂量组(3.0 mg·mL^-1)和低剂量组(1.5 mg·mL^-1)。采用噻唑蓝(MTT)比色法检测2种细胞增殖;流式细胞术检测anti-miR-122-Huh7细胞调亡;采用qRT-PCR法和Western Blot法分别检测miR-122及其转录因子C/EBPα、靶基因IGF-1R及下游AKT3、KRAS、ERK1和CyclinG1基因表达。结果与肝癌Huh7细胞比较,anti-miR-122-Huh7细胞miR-122的表达显著下降、靶基因IGF-1R蛋白表达明显升高(P<0.05),miR-122表达抑制肝癌Huh7细胞构建成功。与对照组比较,叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组作用于肝癌Huh7细胞后,可以显著上调miR-122的表达(P<0.05),并下调IGF-1R mRNA的表达(P<0.05);叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组均可显著抑制Huh7、anti-miR-122-Huh7细胞的增殖(P<0.05),且对anti-miR-122-Huh7细胞抑制作用更为明显(与Huh7细胞比较,P<0.05)。与对照组比较,叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组作用于anti-miR-122-Huh7细胞后,细胞晚期凋亡率及总凋亡率均显著升高(P<0.05);高剂量组的miR-122表达及miR-122的上游转录因子C/EBPα的mRNA和蛋白表达明显上调(P<0.05);高、低剂量组的IGF-1R及下游AKT3、KRAS、CyclinG1基因的mRNA、蛋白表达均显著下调(P<0.05),且ERK1蛋白表达亦明显下调(P<0.05)。结论叶下珠复方Ⅱ号可能通过提高miR-122的表达,抑制IGF-1R信号通路活化,从而抑制肝癌Huh7细胞增殖和促进其凋亡。

叶下珠复方Ⅱ号对肝癌细胞增殖和胰岛素样生长因子-1受体信号通路转录的作用

目的：观察叶下珠复方Ⅱ号（CPUⅡ）对肝癌Huh7细胞增殖以及叶下珠复方Ⅱ号对胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1R）信号通路转录的影响,探讨叶下珠复方Ⅱ号抗肝癌作用机制。方法：采用小分子干扰RNA技术（siRNA）转染肝癌Huh7细胞,构建抑制IGF-1R的肝癌Huh7细胞（anti-IGF-1R Huh7）,选择稳定表达的抑制IGF-1R的肝癌Huh7细胞,将肝癌Huh7细胞以及抑制IGF-1R的肝癌Huh7细胞分别分为4组：空白组,叶下珠复方Ⅱ号高、低质量浓度组（3.0,1.5 g·L^-1）以及5-氟尿嘧啶（5-FU）组（0.03 g·L^-1）,采用噻唑蓝（MTT）比色法测定药物对各组细胞增殖的影响,通过实时荧光定量PCR（Real-time PCR）以及蛋白免疫印迹法（Western blot）检测IGF-1R以及其下游相关指标mRNA及蛋白表达。结果：与空白组比较,转染（SASI_Hs01_00126196及SASI_Hs01_00126196_AS）序列肝癌Huh7 IGF-1R mRNA及蛋白表达量最低,选择该细胞进行实验。MTT比色实验结果表明,与空白组比较,叶下珠复方Ⅱ号能够抑制Huh7细胞以及抑制IGF-1R的肝癌Huh7细胞增殖,并且siRNA抑制IGF-1R基因表达后,叶下珠复方Ⅱ号还能继续抑制Huh 7细胞增殖,且IGF-1R,磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶3（Akt3）mRNA表达量进一步下降（P〈0.05）。结论：叶下珠复方Ⅱ号能够抑制Huh7细胞增殖,作用机制可能是抑制IGF-1R及其下游mRNA转录有关。

叶下珠复方Ⅱ号对人肝癌HepG_2细胞增殖和凋亡作用

目的探讨叶下珠复方II号(CPU II)对体外培养的人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的作用。方法采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法),比较不同浓度的叶下珠复方在不同作用时间对体外培养的HepG2细胞增殖的影响;应用流式细胞术(FCM)结合Annexin V-FITC/PI荧光双染法观察CPU II诱导24h后人肝癌HepG2细胞的凋亡率。结果 MTT结果显示,人肝癌HepG2细胞经叶下珠复方II号处理一定时间后,增殖比率明显下降,2.60mg/ml以上的叶下珠II号对人肝癌HepG2细胞株的增殖有抑制作用(P<0.01;48h P<0.05),且呈一定的量效关系;FCM结果显示,随着叶下珠复方II号浓度的增加(2.6、26.0、130.0mg/ml),细胞的凋亡率也逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论叶下珠复方II号能够抑制人肝癌HepG2细胞生长和增殖,诱导人肝癌HepG2细胞凋亡,呈明显的量效关系。

叶下珠复方Ⅱ号抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

目的评价叶下珠复方Ⅱ号体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用。方法观察不同浓度叶下珠复方Ⅱ号对体外培养的2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响。结果叶下珠复方Ⅱ号对2.2.15细胞的半数毒性浓度(TC50)为16.94mg/ml,对HBsAg和HBeAg的半数有效浓度(IC50)分别为7.82、7.60mg/ml,治疗指数分别为2.17、2.23。结论叶下珠复方Ⅱ号对2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg有较好的抑制作用。

叶下珠复方Ⅱ号对H22肝癌荷瘤小鼠化疗的增效减毒作用

目的观察叶下珠复方Ⅱ号对H22荷瘤小鼠化疗的增效减毒作用。方法取昆明小鼠48只,建立小鼠H22肝癌移植瘤模型,随机分为6组:模型组、叶下珠复方Ⅱ号高剂量组(37.5g/kg)、低剂量组(18.75g/kg)、环磷酰胺(20mg/kg)治疗组、叶下珠复方Ⅱ号(高、低剂量)+环磷酰胺(20mg/kg)组。造模次日开始给药治疗,模型对照组用生理盐水灌胃,叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组灌胃给药,环磷酰胺组采用腹腔注射,联合用药组灌胃叶下珠复方Ⅱ号同时腹腔注射环磷酰胺,每日1次,连续给药8d。于末次给药后24h,检测各组小鼠抑瘤率、肝肾功能、胸腺和脾脏指数。结果叶下珠复方Ⅱ号(高、低剂量)联合环磷酰胺组瘤重均明显低于模型对照组(P<0.01);叶下珠复方II号高、低剂量与环磷酰胺合用后,抑瘤率分别为74.3%和66.9%,均大于两药合用的理论相加效应值72.2%和64.8%。叶下珠复方II号高剂量联合环磷酰胺组脾指数高于环磷酰胺组(P<0.05)、且小鼠的血清ALT、AST、CRE、UREA水平均明显环磷酰胺组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论叶下珠复方Ⅱ号对H22肝癌荷瘤小鼠的化疗具有增效和减毒的双重作用。

叶下珠复方Ⅱ号对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用

目的观察叶下珠复方Ⅱ号对四氯化碳(CCl4)致小鼠急性肝损伤的保护作用,并探讨其作用机制。方法72只昆明小鼠(KM小鼠)随机分为正常组、模型组、叶下珠复方Ⅱ号高剂量组(6.04 g/kg)、中剂量组(3.02 g/kg)、低剂量组(0.604 g/kg)和联苯双酯组(150 mg/kg),给药7 d后,除正常组外,其余各组小鼠均按10 m L/kg腹腔注射0.12%CCl4大豆油溶液,16 h后取小鼠血清,检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性;取肝组织,观察肝组织病理改变,并检测超氧化物歧化酶(SOD)活性、还原性谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)水平变化。结果与模型组比较,叶下珠复方Ⅱ号高、中剂量组可显著降低急性肝损伤小鼠血清ALT、AST活性(P<0.01或P<0.05),显著减轻肝组织病理改变,并提高肝组织SOD活性(P<0.01或P<0.05),降低肝组织MDA水平(P<0.01)。结论叶下珠复方Ⅱ号对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤有较好的保护作用,其作用机制与抗脂质过氧化损伤有关。

叶下珠复方Ⅱ号对肝癌Huh7细胞增殖、凋亡与自噬的影响

目的:观察叶下珠复方Ⅱ号对肝癌Huh7细胞增殖、凋亡与自噬的影响,进一步探讨其抗肝癌的作用机制。方法:体外培养肝癌Huh7细胞,设空白组,叶下珠复方Ⅱ号高、低质量浓度组(40,20 g·L^-1)和5-氟尿嘧啶(5-FU)(0. 04 g·L^-1)组,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测叶下珠复方Ⅱ号对肝癌Huh7细胞增殖的影响,流式细胞仪检细胞凋亡变化,单丹磺酰尸胺(MDC)染色观察药物作用后细胞自噬体的变化,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K),丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶2(Akt2),B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅱ) mRNA表达的改变,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Akt2和LC3Ⅱ蛋白表达的变化。结果:叶下珠复方Ⅱ号(40,20 g·L^-1)可显著抑制肝癌Huh7细胞,并诱导其凋亡,凋亡率分别为51. 72%,19. 74%,显著高于空白组(P <0. 01)。采用MDC染色后,叶下珠复方Ⅱ号(40,20 g·L^-1)组可见大量自噬体的形成。与空白组比较,叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组PI3K,Akt2,Bcl-2 mRNA表达均显著下降,LC3ⅡmRNA表达均显著增加(P <0. 01)。与空白组比较,叶下珠复方Ⅱ号(40,20 g·L^-1)组处理后的Akt2蛋白表达显著下降,LC3Ⅱ蛋白表达明显增加(P <0. 05,P <0. 01)。结论:叶下珠复方Ⅱ号对肝癌Huh7细胞增殖有明显的抑制作用,其作用机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路活化从而诱导细胞凋亡和自噬有关。

叶下珠复方Ⅱ号对肝星状细胞增殖和miR-122/KLF6表达的影响

目的观察叶下珠复方Ⅱ号对肝星状细胞(HSC-T6)增殖及miR-122/KLF6表达的影响,探讨其抗肝纤维化的作用机制。方法体外培养HSC-T6细胞,分为空白对照组、叶下珠复方Ⅱ号高剂量组(120 g/L)和低剂量组(60 g/L),采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测药物对HSC-T6细胞增殖的影响,实时荧光定量PCR法检测药物处理后HSC-T6细胞miR-122、KLF6和TGF-β1 m RNA表达的改变,Western blot法检测KLF6蛋白表达的变化。结果叶下珠复方Ⅱ号处理HSC-T6细胞后,叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组对HSC-T6细胞增殖均有明显的抑制作用。叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组HSC-T6细胞的miR-122表达增加,尤以高剂量组作用显著,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组KLF6 m RNA和蛋白表达均显著减少,TGF-β1 m RNA的表达明显抑制,与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),并呈明显的剂量-效应关系。结论叶下珠复方Ⅱ号能显著抑制HSC-T6细胞增殖,其作用机制与提高miR-122的表达、抑制其靶基因KLF6的m RNA和蛋白质表达有关。