鼠胚髁突外植体无血清培养模型的建立与评价

目的体外建立髁突软骨外植体无血清培养模型,为研究髁突软骨发育改建及各种因子对髁突软骨作用提供适宜手段。方法体外解剖分离鼠胚髁突,行外植体培养,通过组织学、免疫组织化学等方法观察髁突外植体在无血清和含血清体外培养系统中的生长和组织分化状况。结果在无血清培养20天后,髁突软骨膜与软骨层保持紧密结合,尽管部分肥大层软骨排列紊乱,阿辛蓝及Ⅱ、X型胶原染色显示培养软骨组织能形成软骨基质。在含血清的对照组中,软骨组织分化层次过程紊乱,纤维层过度增生并与软骨分离,软骨基质减少,软骨部分降解。结论此无血清培养髁突外植体模型中髁突软骨能正常发育,髁突软骨细胞增殖与分化与体内状态接近,此培养系统可用来体外研究髁突发育以及各种环境因子对髁突生长、发育、生理改建的影响。

改良组织块培养法体外培养人角膜上皮干细胞

背景:角膜上皮干细胞定位于角膜缘,又称之为角膜缘干细胞,临床上由于眼表严重热烧伤、化学性烧伤、慢性炎症等原因引起的角膜缘干细胞缺乏或功能障碍治疗较为棘手。目前利用组织工程技术体外培养角膜上皮干细胞并进行临床移植成为新型有效的治疗方向。目的:探讨在无血清培养条件下采用改良组织块培养法培养人角膜上皮干细胞的可行性。方法:人角膜缘组织来自河南省眼库,植片直径小于8 mm角膜移植术后的供者剩余眼球材料,手术显微镜下剖取角膜缘上皮层外2/3区域,采用2种方法培养人角膜上皮干细胞,常规组织块培养组是将组织块上皮面向上贴壁,加入K-SFM培养液后置于37℃、体积分数为5%CO 2细胞培养箱中培养;改良组织块培养组是先将组织块浸泡于K-SFM培养液中,置于细胞培养箱中孵育12 h,然后组织块上皮面向下贴壁培养。组织块周边有细胞游离出贴壁生长记作“培养第1天”,每日相差显微镜下观察细胞生长变化。利用免疫荧光染色技术检测改良组织块培养第5,10,14天时原代细胞中p63及K3的表达。结果与结论:①改良组织块培养组出膜时间明显短于常规组织块培养组(P<0.05),出膜率明显高于常规组织块培养组(P<0.05);②改良组织块培养组细胞生长状态良好,培养第10天可见小体积细胞较多,聚集成灶状分布;培养第14天可见细胞克隆灶,克隆灶内细胞体积较小,形态均一;③培养第5天,K3表达量较多,p63表达量较少;培养第10天,K3和p63表达量均增多;培养第14天,K3表达量未见明显增多,p63表达量明显增多;④在无血清培养条件下,改良组织块培养法能显著促进角膜上皮干细胞的游离,提高体外培养细胞数量,为人角膜缘上皮组织片的构建提供种子细胞。

无血清条件下组织块法培养人角膜上皮细胞的比较

目的比较无血清条件下不同组织块法培养人角膜上皮细胞的出膜时间及出膜率。方法培养方式:A组:剥除角膜内皮及刮除角膜上皮后组织块角膜上皮面向上贴壁;B组:剥除角膜内皮及刮除角膜上皮后组织块角膜上皮面向下贴壁;C组:仅剥除角膜内皮后全层组织块角膜上皮面向上贴壁;D组:仅剥除角膜内皮后全层组织块角膜上皮面向下贴壁。相差显微镜观察细胞形态学变化,对比各组出膜时间及出膜率。结果 A组:细胞爬出时间(7.00±3.00)d,出膜率47.50%(19/40);B组:细胞爬出时间(7.55±2.58)d,出膜率45.83%(11/24);C组:细胞爬出时间(8.43±3.32)d,出膜率63.64%(14/22);D组:细胞爬出时间(7.49±2.20)d,出膜率72.22%(39/54)。卡方检验结果示,A组与D组、B组与D组出膜率相比,差异均有统计学意义(均为P<0.05),余组间两两比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论无血清条件下不同组织块培养方式细胞爬出时间大致相同,约一周。相比较而言,仅剥除角膜内皮后全层组织块角膜上皮面向下贴壁培养法出膜率明显较高,且培养的细胞更纯、更稳定。

二次贴壁法高效制备人脐带间充质干细胞

目的采用二次贴壁法高效制备人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)。方法将传统组织块贴壁法弃掉的脐带组织块转移至新的培养瓶中进行二次贴壁,分离hUC-MSCs,并用无血清培养体系连续传代,镜下观察细胞形态;分别检测不同代次细胞的增殖能力、细胞周期、免疫表型、多向分化能力。结果二次贴壁法分离的hUC-MSCs在第4天即出现细胞克隆,第8天汇合度可达70%,经过二次贴壁法,1根20 cm的脐带组织共获得P3间充质干细胞(MSCs)总数为1×10~9个。二次贴壁分离的细胞增殖能力旺盛,与一次贴壁获得的干细胞同代次平均倍增时间差异无统计学意义(P>0.05)。传统贴壁法与二次贴壁分离的细胞均表达超过98%的CD73、CD90、CD105和低于2%的CD34、CD45、CD14、CD79a、HLA-DR,且该细胞具有分化为成骨、成软骨和成脂能力。结论经无动物源培养体系体外扩增的二次贴壁分离方法可以获得大量具有MSCs生物学特性的hUC-MSCs,为其规模化临床应用奠定了基础。