结缔组织生长因子的分泌表达及ELISA检测法的建立

目的 制备结缔组织生长因子 (CTGF)抗原 ,建立ELISA检测方法。方法 从血管内皮细胞中提取总RNA ,逆转录合成cDNA ,设计特异性引物 ,通过PCR方法扩增CTGFC区 2 4 2～ 349位氨基酸基因 ,插入噬菌体包膜蛋白基因Ⅲ的上游 ,制备CTGF融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫家兔 ,获得抗体 ,抗体纯化后标记HRP ,建立ELISA。结果 成功克隆CTGFC区基因 ,插入表达载体经IPTG诱导后获得分子量为 2 5 0 0 0的融合蛋白 ,免疫学检测证实为CTGF。所得抗体用HRP标记。建立的ELISA法检测灵敏度为 2ng/ml,批内及批间平均变异系数为 5 .4 %和 7.5 % ,平均回收率为 10 4 .2 %。血红蛋白浓度在 0～ 5 0mmol/L ,总胆红素在 0～ 15 0 μmol/L ,三酰甘油在 0～ 2 .0mmol/L对测定结果无影响。 2例慢性乙型肝炎病人血标本 ,5例糖尿病肾病、3例肾功能衰竭、3例慢性肾炎尿标本为阳性。结论 CTGF可以作为判断纤维化发生、进展及预后的一个新指标。CTGFELISA检测方法的成功建立 。

碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体ELISA微量检测技术

目的:用本室制备的单克隆抗体建立间接ELISA检测微量bFGF的技术。方法:将抗重组牛碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的杂交瘤细胞株,经再克隆化,选择高亲和力的抗bFGF杂交瘤细胞2H2。用ProteinA亲和层析法对2H2腹水型单抗进行纯化。结果:用2H2mAb建立了高灵敏度的间接、竞争ELISA检测bFGF方法,灵敏度分别达到10和1.0pg/孔,并用间接ELISA检测神经胶质瘤细胞SWO38上清中的bFGF含量。结论:为实验研究和临床应用提供了微量bFGF的检测方法。

Filtering bleb area and intraocular pressure following subconjunctival injection of CTGF antibody after glaucoma filtration surgery in rabbits

AIM: To study the role of connective tissue growth factor (CTGF) antibody in inhibiting bleb scarring after glaucoma filtration surgery (GFS) in rabbit model. METHODS: GFS was performed on both eyes in five rabbits. One eye of each rabbit was chosen randomly as antibody group and received subconjunctival injection of 0.1mL CTGF antibody (50mg/L) immediately after GFS applied and on the 5 th day after GFS. The other eye of each rabbit as control group was received subconjunctival injection of 0.1mL PBS at the same time as antibody group. On postoperative days 1, 3, 5, 7, 10, and 14, the appearance of filtrating blebs was observed under slit lamp, the area and the intraocular pressure (IOP) were measured with micrometer and applanation tonometer, respectively. RESULTS: On postoperative days 1, 3, 5, 7, 10, and 14, areas of filtrating blebs in antibody group were all larger comparing with the control group (P<0.05) and IOPs of antibody group were lower than the control group(P<0.05). CONCLUSION: Subconjunctival injection of CTGF antibody can maintain larger bleb area and lower IOP after GFS in rabbit.

单抗体夹心ELISA定量检测人神经生长因子试剂盒的研制

目的制备抗人神经生长因子（h NGF）单克隆抗体,并开发一种检测h NGF含量的ELISA试剂盒。方法以重组人神经生长因子抗原与弗氏完全佐剂混合免疫BALB/c小鼠,并采用杂交瘤技术制备抗h NGF的单克隆抗体,然后建立快速检测h NGF含量的ELISA检测试剂盒。结果获得1株可分泌抗h NGF单克隆抗体的杂交瘤细胞株。建立1种检测h NGF含量的ELISA试剂盒,该检测方法的回收率为85%-105%,灵敏度为0.63 ng/ml,变异系数〈10%,且特异性良好。结论成功制备了抗h NGF的单克隆抗体,并建立了一种可快速检测h NGF含量的ELISA试剂盒。

夹心ELISA检测血清结缔组织生长因子及其初步临床应用

目的应用抗结缔组织生长因子(CTGF)单克隆抗体和抗CTGF多克隆抗体,建立CTGF免疫分析方法 ,用其方法检测血清中CTGF含量初步验证其临床应用价值。方法使用抗CTGF的单克隆抗体包被反应板,辣根过氧化物酶标记兔抗人CTGF多克隆抗体(二抗)建立双抗体夹心方法 ,通过方阵滴定法确定包被抗体和酶标抗体的最适工作浓度;以纯化的CTGF抗原为标准品建立标准曲线;以重复性、灵敏性和回收率实验评价ELISA方法。使用该检测系统和进口试剂盒对照,检测其准确性和可比性。利用该系统检测临床有肝纤维化症状的患者血清标本,初步评价其临床应用价值。结果该方法有较高的灵敏度、特异性及稳定性,最低检测限批间和批内变异系数分别为0.98 ng/ml、9.8%、4.9%。与进口试剂盒有很强的可比性,两者的相关系数r=0.988。初步临床标本检测证实,肝硬化、慢性肝炎急性肝炎患者的血清CTGF含量明显高于建康对照者(P<0.01),肝硬化患者的血清CTGF水平明显高于慢性肝炎和急性肝炎患者(P<0.01)。结论成功地建立了一种测定血清CTGF的双抗体夹心方法 ,该反应系统有较高的灵敏度和特异性,和进口试剂盒有很强的可比性,为临床广泛使用打下了基础。

血管内皮细胞生长因子的表达及其单克隆抗体的制备

目的表达、纯化血管内皮细胞生长因子(VEGF165)蛋白,并制备其单克隆抗体。方法将pGEX-4T-1/VEGF165表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达GST-VEGF165融合蛋白,并采用十二烷基肌氨酸钠溶解,亲和层析纯化。用获得的GST-VEGF165蛋白免疫小鼠,制备抗GST-VEGF165单克隆抗体,并进行鉴定及初步应用。结果表达的GST-VEGF165融合蛋白相对分子质量约为45000,表达量约占菌体总蛋白的20%,纯化后蛋白纯度大于90%,并具有与其受体结合的活性,亲和力约为109L/mol。免疫小鼠后,获得1株抗GST-VEGF165的单克隆抗体,反应原性良好,亚类为IgG2a,解离常数为2×10-9mol/L。以此单抗为包被抗体,建立了双抗体夹心ELISA法,VEGF165的最佳检测范围为1.5625～25ng/ml。结论成功表达、纯化了VEGF165蛋白,并制备出VEGF165单克隆抗体,为VEGF检测试剂盒的研制奠定了基础。

重组人碱性成纤细胞生长因子单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的制备重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor,rhbFGF)单克隆抗体,鉴定其特性,建立双抗体夹心ELISA检测方法。方法以rhbFGF为免疫原,免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合技术建立能稳定分泌抗rhbFGF杂交瘤细胞株,制备抗rhbFGF单克隆抗体,采用Ig亚类ELISA试剂盒鉴定抗体亚类,间接ELISA法检测抗体效,Western blot鉴定抗体特异性。HRP标记McAb并建立夹心ELISA检测方法。结果获得2株(分别命名2D3、5F7)可分泌特异性McAb的强阳性细胞株,腹水抗体效价在10-5以上,IgG亚类均为IgG1,轻链为K链。Western blot证明2株McAb特异性良好,双抗体夹心ELISA检测rhbFGF最低检测限达到2 ng/ml。结论成功制备高效价的抗rhbFGF单克隆抗体,建立抗rhbFGF双抗体夹心ELISA定量检测方法。

结膜下注射CTGF抗体对兔青光眼滤过手术后眼压和滤过泡面积的影响

目的:探讨结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)抗体对兔青光眼滤过手术后滤过泡瘢痕化的抑制作用。方法:家兔5只双眼制作青光眼滤过手术模型。随机选取家兔一眼作为抗体组,分别于手术完成当时和术后5d结膜下注射0.1mL浓度为50mg/L的CTGF抗体;另一眼作为对照组在相同时间点结膜下注射0.1mL磷酸盐缓冲液。术后1,3,5,7,10,14d分别观察滤过泡形态并测量其面积和眼压值。结果:术后7,10和14d抗体组滤过泡面积均大于对照组(P<0.05),眼压均小于对照组(P<0.05)。结论:结膜下注射CTGF抗体可维持兔眼滤过手术后较大的滤过泡面积和较低的眼压。

结缔组织生长因子单克隆抗体超微超顺磁氧化铁粒子的制备及其生物活性的研究

目的:通过化学合成方法制作结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)单克隆抗体超微超顺磁氧化铁(ultrasmall superparamagnetic iron oxide,USPIO)粒子分子探针,并检测其生物活性。方法:采用EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylamin-opropyl]carbodiimide hydrochloride)化学连接剂将CTGF单克隆抗体与DMSA[meso-2,3-dimercaptosuccinic acid(HOOCCH(SH)-CH(SH)-COOH)]修饰的USPIO相结合,形成具有免疫活性的分子探针。通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及Western blot-ting方法检测其生物稳定性及免疫活性。结果:随着加入不同质量的单克隆抗体,ELISA试验所得的吸光度值随抗体含量增加而增大,与阴性对照USPIO组相比较差异显著(P<0.05),分别间隔30 d及60 d后再次测量,只有200μg单抗组吸光度值降低(P<0.05)。Western blotting试验显示,结合单抗的USPIO及单纯单抗均显示出条带,且前者较浅,而单纯USPIO对照组则未显示条带。结论:EDC化学方法可制备出结缔组织生长因子单克隆抗体超顺磁氧化铁粒子,同时仍具有抗体的生物活性及生物稳定性。

自身抗体在狼疮肾炎病理与诊断研究中的进展

狼疮肾炎(lupus nephritis,LN)的发病机制较为复杂,临床医师诊断和治疗LN的依据尚未明确。尽管在以往美国风湿病学会(American College of Rheumatology,ACR)与系统性红斑狼疮国际合作诊所(Systemic Lupus International Collaborating Clinics,SLICC)修订的分类标准中,抗dsDNA与抗Sm抗体均被用作诊断系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)及LN的标志性抗体,但抗C1q、抗核小体及结缔组织生长因子等抗体也对SLE尤其LN存在较高的特异性,它们在LN的发病及演变机制中也起到较为重要的作用,有望成为诊断LN的新标志。另外,越来越多的研究者着眼于采用两种或多种相关性自身抗体的联合检测,在多种诊断依据的支持下,可以为临床诊断及治疗LN患者提供更好的依据,从而更准确高效地诊断LN,且有助于LN病理类型的确诊,提高非活动期LN的检出率。

血浆组织因子途径抑制物抗原含量的测定

组织因子途径抑制物是新确定的一种抗凝蛋白,它通过抑制因子Ⅹa和因子Ⅶa/组织因子(TF)而发挥抗凝作用。研究表明,血浆TFPI的改变与某些恶性肿瘤、败血症、血栓性疾病及DIC等多种疾病相关联。因此,对它的检测将有助于这些疾病病因病机的研究及临床诊断。鉴于国内目前尚未建立TFPI抗原检测方法,亦未确定国人TFPI血浆水平。本文报道了利用抗TFPI单克隆抗体用双抗夹心ELISA法检测了30例正常人血浆TFPI含量。

人结缔组织生长因子单克隆抗体的制备及鉴定

用纯化的人结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)免疫BalB/C小鼠,采用杂交瘤技术制备CTGF单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),获得2株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系7C7和8A11。两株细胞染色体众数分别为95条和91条;单抗亚类鉴定结果显示2株单抗均为IgG1型;间接ELISA法测定7C7和8A11腹水效价分别为:1.3×105和8.1×104;相对亲和力:7C7>8A11。CTGF单克隆抗体的制备为相关实验研究和临床诊断提供了条件。

结缔组织生长因子单链抗体对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响

目的:研究结缔组织生长因子(CTGF)单链抗体(ScFv)对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型各阶段的支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞数及纤维化程度的影响。方法:昆明小鼠36只,随机分为对照组、模型组和ScFv组,每组12只;后2组麻醉后气管内滴入博莱霉素制备模型,滴药后第2天开始尾静脉分别注入生理盐水或ScFv(4 mg.kg-1),3次.周-1,对照组给予等量的生理盐水;气管内滴药后第7、14、28天分3批处死小鼠,收集左肺BALF,进行炎症细胞计数和分类;肺组织HE染色后观察肺纤维化程度。结果:(1)第7天模型组有明显的肺泡炎,ScFv组小鼠肺泡炎症病变轻微;第28天模型组出现肺纤维化,ScFv组纤维化程度明显低于模型组(P<0.05);(2)第7、14天模型组小鼠BALF中细胞总数及巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞均明显高于对照组(P<0.05),ScFv组明显低于模型组(P<0.05)。结论:CTGF ScFv可减少肺纤维化模型BALF中的炎症细胞,减缓肺纤维化的发生发展。

抗人结缔组织因子人源单链抗体的筛选、表达及活性鉴定

目的从人源噬菌体抗体文库中筛选抗人结缔组织生长因子(CTGF)单链抗体(ScFv),原核表达并鉴定其活性。方法以重组人源CTGF(rhCTGF)为靶标,对人源噬菌体抗体文库进行筛选;用Phage-ELISA筛选阳性克隆并进行原核表达、纯化,获得了高纯度的ScFv蛋白,通过ELISA和Millicell迁移实验鉴定其活性。结果经过3轮筛选,获得1株特异性抗人CTGF ScFv 1C5,ELISA显示1C5能与rhCTGF特异性结合;在Millicell迁移实验中,1C5能抑制CTGF的生物学功能,具有中和活性。结论成功筛选到1株抗人CTGF的ScFv,有望在CTGF相关疾病的治疗上发挥作用。

一种新型结缔组织生长因子人源单链抗体的可溶性表达以及分离纯化

目的:研究单链抗体(scFv)在不同载体和菌株中的表达以及表达产物的免疫学活性评价。方法:将人源化单链抗体的基因通过酶切、连接等生物技术的方法克隆到pET28a、pET32a和pET-EI:X3种不同的载体中,并选用不同的表达菌株进行表达,观察单链抗体的表达情况并对抗体的可溶性表达进行优化,采用亲和层析和分子筛层析对目的蛋白进行纯化,并在体外研究目的蛋白的生物学活性。结果:抗结缔组织生长因子单链抗体在pET28a/BL21(DE3)中不能表达,在pET32a/BL21(DE3)和pET-EI:X/BLR(DE3)中均成功表达,但是在pET-EI:X/BLR(DE3)中scFv抗体无法从内含肽(intein)上裂解。scFv在pET32a/BL21(DE3)中表达量占总蛋白的30%左右,经过两步层析纯化后纯度达到85%以上。体外免疫试验显示,目的蛋白具有良好的免疫学活性。结论:人源化抗结缔组织生长因子单链抗体scFv在大肠杆菌中的表达需要分子伴侣,通过低温表达策略在pET32a/BL21(DE3)中成功得到表达。

地塞米松对人口腔扁平苔藓成纤维细胞CTGF和IL-6的影响

目的:研究不同浓度地塞米松对体外培养的人口腔扁平苔藓黏膜成纤维细胞分泌的细胞因子CTGF和IL-6的影响。方法:将不同浓度地塞米松加入体外培养的人口腔扁平苔藓黏膜成纤维细胞,并依此分为实验Ⅰ组、实验Ⅱ组和实验Ⅲ组,对照组细胞加入等体积无菌PBS,培养48 h、72 h后收集上清液,应用酶联免疫吸附剂测定(ELISA)技术检测并比较各组细胞分泌的细胞因子CTGF和IL-6蛋白的变化。结果:3个实验组细胞的CTGF和IL-6蛋白浓度较对照组显著降低,实验Ⅲ组细胞较实验Ⅰ组和实验Ⅱ组的IL-6蛋白浓度低。结论:地塞米松体外可能通过抑制人口腔扁平苔藓细胞因子CTGF和IL-6的分泌,抑制了炎症反应。

扩张型心肌病患儿外周血抗β1肾上腺素能受体抗体与结缔组织生长因子表达的意义

目的探讨抗β1肾上腺素能受体抗体（β1AA）与结缔组织生长因子（CTGF）在扩张型心肌病（DCM）患儿外周血的表达及其临床意义。方法选取2015年10月至2016年4月于山东大学附属省立医院小儿心脏科初诊为DCM且处于急性期的患儿27例为DCM组，选取同期于山东大学附属省立医院儿科体检的健康儿童20例为健康对照组。根据改良Ross心力衰竭（心衰）分级计分法对DCM组患儿进行心衰评分，采用超声心动图测定2组儿童左心室舒张末期内径（LVEDD）与左心室射血分数（LVEF），应用酶联免疫吸附法测定2组儿童血清中β1AA、CTGF、超敏肌钙蛋白T（hs-TnT）及N端脑钠肽前体（NT-proBNP）水平。结果1.DCM组与健康对照组儿童年龄、性别差异均无统计学意义（均P〉0.05）。2.DCM组患儿β1AA水平、CTGF水平及LVEDD[（260.23±34.03） ng/L、（1 223.44±190.85） ng/L、（53.02±11.01） mm]均显著高于健康对照组[（224.80±34.90） ng/L、（937.16±114.50） ng/L、（32.51±5.95） mm]，DCM组LVEF值显著低于健康对照组[（28.15±7.34）%比（64.15±0.88）%]，差异均有统计学意义（t＝－3.49、－5.95、－7.54、21.74，均P〈0.01）。3.在DCM组中，hs-TnT增高的患儿外周血中β1AA水平、CTGF水平均明显高于hs-TnT正常的患儿[（269.56±34.78） ng/L、（1 276.88±189.38） ng/L比（233.56±8.30） ng/L、（1 070.76±86.87） ng/L]，差异均有统计学意义（t＝－2.68、－2.75，均P〈0.05）。4.不同性别的DCM患儿外周血中β1AA水平、CTGF水平比较，差异均无统计学意义（均P〉0.05）。5.DCM组β1AA水平与NT-proBNP水平、改良Ross评分均呈正相关（r＝0.745、0.813，均P〈0.01），与LVEF值呈负相关（r＝－0.646，P〈0.01），与年龄无相关性（P〉0.05）。CTGF水平与NT-proBNP水平、改良Ross评分均呈正相关（r＝0.798、0.823，均P〈0.01），与LVEF值呈负相关（r＝－0.642，P〈0.01），与年龄无相关性（P〉0.05）。结论在DCM儿童中，β1AA和CTGF表达水平均增高，与患儿hs-TnT水平、NT-proBNP水平、改良Ross评分、LVEF值均有一定的关系，能反映疾病的严重程度，可辅助评估DCM患儿病情变化。

结缔组织生长因子抗体抑制慢性卡压后神经纤维化的研究

目的观察结缔组织生长因子（CTGF）抗体对慢性卡压致神经纤维化的抑制作用。方法将实验大鼠分为A、B、C3组。A组（假手术组）：仅暴露坐骨神经；B组（单纯卡压组）：依照Mackinnon建立坐骨神经慢性卡压模型设计的方法行坐骨神经套管卡压术；C组（卡压＋抗体注射组）：行坐骨神经卡压术，并在术中及术后3、6、9d定时注射CTGF多克隆抗体，A、B两组在相同部位注射等量的生理盐水做对照。于术后2、4、6、8、10周取神经行电镜、免疫组织化学、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Westernblot等检测方法分别检测不同时段卡压神经组织形态学变化及CTGF、I型、Ⅲ型胶原蛋白（COL-I、Ⅲ）含量。结果坐骨神经单纯卡压组较假手术组CTGF、COL-I、Ⅲ含量明显增多；CTGF多克隆抗体注射组神经形态学上纤维组织明显减少，COL-I、Ⅲ含量降低，B组和C组神经中COL．ImRNA表达量分别为：2周组（27．96±2．89、19．83±2．86）、4周组（32．29±3．58、24．18±3．17）、6周组（35．26±3．42、29．48±2．19），与单纯卡压组差异有统计学意义（P〈0．05）。结论周围神经慢性卡压后可致神经纤维化，CTGF在此纤维化过程中起重要作用；CTGF抗体可有效抑制周围神经卡压后胶原合成，缓解慢性卡压后神经纤维化病变。

三种抗体联合检测诊断狼疮肾炎活动性的临床意义

目的探讨LN患者联合检测抗C1q抗体、抗核小体抗体(AnuA)和结缔组织生长因子(CTGF)的意义和价值。方法收集哈尔滨医科大学附属第二医院2018年6月至12月收治的38例SLE患者,其中15例符合LN诊断标准,23例为非LN患者。选取同期肾内科收治的肾病综合征患者21例肾病综合征患者及其他免疫病患者组24例。比较4组患者自身抗体的水平变化。采用χ^2检验、成组设计的t检验及Logistics回归方法进行数据分析。结果LN组抗C1q抗体、AnuA及CTGF阳性率分别为60%、73%、67%,均高于肾病综合征患者[10%(χ^2=10.51,P<0.05);26%(χ^2=7.03,P<0.05);24%(χ^2=6.61,P<0.01)]与其他免疫病患者组[12%(χ^2=12.17,P<0.05);17%(χ^2=12.32,P<0.05);14%(χ^2=12.59,P<0.05)]。3种抗体C1q、AnuA及CTGF水平与补体C3、C4也呈负相关[(r=-0.24,P<0.05;r=-0.21,P<0.05;r=-0.29,P<0.01)与(r=-0.31,P<0.01;r=-0.19,P<0.05;r=-0.47,P<0.01)],AnuA及抗C1q抗体与IgG、IgM呈正相关[(r=0.51,P<0.01;r=0.34,P<0.01)与(r=0.35,P<0.01;r=0.33,P<0.01)],同时。3种抗体的单独诊断特异度为67.4%、65.9%、83.5%,联合检测的特异度为87.2%。结论抗C1q抗体、AnuA和CTGF对LN的诊断有重要价值,可提高LN的诊断特异性及疾病活动检出率,为早期治疗提供实验室依据。

重组人源化兔抗血管内皮生长因子单克隆抗体的抗原结合活性测定

目的采用直接ELISA法测定重组人源化兔抗血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)单克隆抗体的抗原结合活性。方法以VEGF-Fc为包被抗原,采用直接ELISA法测定不同浓度重组人源化兔抗vEGF单抗参考品和供试品与抗原的结合活性,根据供试品及参考品的EC50值计算供试品的相对结合力,并分析该法的精密性。结果重组人源化兔抗VEGF单抗供试品及参考品的抗原结合均存在量效关系,且符合四参数方程。同一批次的供试品单抗原液的相对结合活性分别为参考品的(90.43±18.74)%、(123.56±18.40)%和(106.83±18.47)%,均值为(106.94±16.57)%。3次试验的变异系数分别为20.72%、14.89%和17.29%。同一批次的供试品成品的相对结合活性分别为(97.34±18.42)%、(123.30±11.08)%和(93.91±4.57)%,变异系数分别为18.93%、8.96%和4.87%。结论 直接ELISA法精密性良好,操作简便,可用于重组人源化兔抗VEGF单抗抗原结合活性的常规检测。