人脑胶质瘤Cx43基因表达及其与肿瘤细胞增殖关系的研究

目的探讨缝隙连接蛋白43(Cx43)基因表达与胶质瘤细胞增殖之间的关系,及其在胶质瘤发生发展中的作用,拟为手术后治疗及疗效观察提供客观依据。方法采用原位杂交和免疫组织化学染色方法检测胶质瘤细胞cx43 mRNA、Cx43蛋白和增殖细胞核抗原的表达水平。结果对照脑组织和胶质瘤细胞Cx43 mRNA阳性表达率分别为100%(10/10)和61.70%(29/47),差异具有统计学意义(z=-5.407,p=0.000);低度恶性(WHO Ⅰ～Ⅱ级)胶质瘤细胞Cx43 mRNA阳性表达率为100%(7/7)和93.75%(15/16),高度恶性(WHOⅢ～Ⅳ级)为33.33%(6/18)和16.67%(1/6);Cx43 mRNA阳性表达率与胶质瘤组织病理学分级呈负相关(r=-0.794,P=0.000)。对照脑组织和胶质瘤细胞Cx43蛋白表达水平与Cx43 mRNA基本一致。对照脑组织增殖细胞核抗原表达阴性;不同级别胶质瘤细胞增殖细胞核抗原阳性表达率依次为WHOⅣ级100%(6/6)、WHOⅢ级94.44%(17/18)、WHOⅡ级62.50%(10/16)和WHO 1级42.86%(3/7);增殖细胞核抗原阳性表达率与胶质瘤组织病理学分级呈正相关(r=0.589,P=0.000);WHO Ⅲ～Ⅳ级与WHO Ⅰ～Ⅱ级之间差异具有统计学意义(H=13.239,P=0.000)。Cx43 mRNA与Cx43蛋白表达水平呈正相关(r=0.963,P=0.000),Cx43 mRNA及其蛋白质与增殖细胞核抗原表达水平呈负相关(r=-0.621,p=0.000;r=-0.913,P=0.000)。结论胶质瘤细胞Cx43 mRNA及其蛋白质与增殖细胞核抗原表达水平和肿瘤组织病理学分级呈负相关。提示,Cx43基因表达与肿瘤细胞增殖活性和胶质瘤恶性进展密切相关。

真核表达载体pcDNA3.0-Cx43的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的 :构建携带间隙连接蛋白connexin 4 3(Cx 4 3)cDNA的真核表达载体 ,转染骨髓基质干细胞 ,观察间隙连接蛋白Cx 4 3在骨髓基质干细胞中的过量表达 .方法 :目的基因Cx 4 3cDNA在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体pcD NA3.0 ,转染大鼠骨髓基质干细胞 ,用G4 1 8筛选得到Cx 4 3基因高表达的细胞 ;对照组为pcDNA3.0直接转染骨髓基质干细胞 .结果 :酶切电泳结果显示按设计构建的载体pcDNA3.0 Cx4 3,经G4 1 8筛选得到不同抗性的骨髓基质干细胞 ,免疫细胞化学显示有Cx 4 3蛋白的表达 .结论 :Cx 4 3可以在骨髓基质干细胞中表达 .

丹参酮ⅡA对骨髓间充质干细胞心肌方向分化间隙连接蛋白43表达的干预作用

【目的】研究丹参酮ⅡA对骨髓间充质干细胞(MSCs)心肌方向分化间隙连接蛋白43(Cx43)表达的干预作用。【方法】体外培养大鼠MSCs,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blotting和免疫荧光技术检测不同组间MSCsCx43表达。【结果】未分化的MSCs上Cx43有弱的表达;5-氮胞甙(5-aza)、正常心肌上清液以及缺氧心肌上清液诱导后Cx43的表达显著升高(P<0.01);丹参酮高剂量组(1.5×10-7 mol/L)Cx43的表达量显著增加(P<0.05),丹参酮低剂量组(1.5×10-8mol/L)也显著升高(P<0.01);经缺氧心肌上清液和丹参酮共同干预后,Cx43表达较对照组均显著升高,但丹参酮低剂量组作用更加显著(P<0.01);缺氧心肌上清液和丹参酮低剂量组联合干预之后Cx43表达接近正常心肌细胞组(P>0.05),各组间荧光强度的变化与RT-PCR和Western blotting的结果一致。【结论】不同浓度丹参酮ⅡA可上调MSCs上Cx43表达,但丹参酮ⅡA和缺氧心肌上清液联合诱导作用更强。

桉叶油含药血清联合维甲酸对体外培养神经干细胞Pax3及Cx43的影响

目的探讨桉叶油联合维甲酸(RA)对神经干细胞Pax3、Cx43蛋白及基因表达水平的影响。方法原代培养神经干细胞并进行鉴定,收集传代后第二代的神经干细胞,分别加入5%鼠血清(自由饮食SD大鼠血清,溶剂花生油灌胃鼠血清,桉叶油1 500、1 000、300 mg/kg灌胃鼠血清),5%鼠血清联合RA(5μmol/L)(自由饮食SD大鼠血清+RA,溶剂花生油灌胃鼠血清+RA,桉叶油1 500、1 000、300 mg/kg灌胃血清+RA)和RA(5μmol/L)培养48 h,收集细胞,提取蛋白,采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测细胞Pax3、Cx43蛋白表达水平;提取RNA,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞Pax3、Cx43基因表达水平。结果 (1)用5%鼠血清作用于细胞后,与正常血清组比较,桉叶油含药血清各组的Cx43蛋白及mRNA表达水平均较高(P<0.05),Pax3蛋白及mRNA表达水平均较低(P<0.05),提示桉叶油含药血清具有上调细胞的Cx43蛋白及其mRNA表达,下调细胞Pax3蛋白和mRNA表达的作用。(2)用5%鼠血清联合RA作用于细胞后,与单纯RA组比较,血清各组Pax3蛋白及mRNA表达水平均降低(P<0.05);桉叶油含药血清各组的Pax3蛋白及mRNA表达水平均较正常血清组显著降低(P<0.05)。(3)与单纯RA组比较,血清各组Cx43蛋白及mRNA表达水平均降低;但桉叶油含药血清各组的Cx43蛋白及mRNA表达水平与正常血清组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 (1)桉叶油含药血清具有上调细胞的Cx43蛋白及其mRNA表达,下调细胞Pax3蛋白和mRNA表达的作用。(2)桉叶油含药血清具有拮抗RA上调细胞的Pax3、Cx43蛋白及其mRNA表达的作用。

丝胶对糖尿病大鼠视网膜微血管的保护作用及其作用机制

背景糖尿病视网膜病变（DR）是一种慢性炎症性疾病，并伴有微血管病变。研究证实丝胶具有抗炎和抗氧化功能，但其是否对DR早期的微血管结构和功能有保护作用目前仍不十分清楚。目的观察丝胶对糖尿病大鼠视网膜中细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）、Cx43表达的影响，探讨其对糖尿病大鼠视网膜微血管病变的防护作用。方法将48只SPF级健康雄性SD大鼠按计算机数字随机分配法分为正常对照组、糖尿病模型组、丝胶治疗组和羟苯磺酸钙阳性对照组，每组12只。糖尿病模型组、丝胶治疗组、羟苯磺酸钙阳性对照组大鼠均采用链脲佐菌素（STZ）连续腹腔内注射3d并给予高脂饲料饮食法制备糖尿病大鼠模型，成模后分别用生理盐水、2．4g／（kg·d）丝胶溶液和0．2s／（kg·d）羟苯磺酸钙灌胃3个月。采用过量麻醉法处死大鼠并制备视网膜标本，采用苏木精-伊红染色法观察各组大鼠视网膜组织的形态学变化。分别采用Western blot法和逆转录PCR技术检测大鼠视网膜中ICAM-1、VCAM-1和Cx43蛋白及其mRNA的相对表达量，并对各组检测结果进行比较。结果正常对照组大鼠视网膜组织结构正常，糖尿病模型组视网膜可见内界膜肿胀或断裂，偶见突出于内界膜的毛细血管内皮细胞，视网膜神经节细胞（RGCs）数量减少，丝胶治疗组和羟苯磺酸钙阳性对照组大鼠视网膜内界膜轻度增厚，内外核层细胞排列稍欠规则。糖尿病模型组、丝胶治疗组和羟苯磺酸钙组阳性对照大鼠视网膜中ICAM-1和VCAM-1蛋白相对表达量较正常对照组大鼠均明显升高，而Cx43相对表达量均明显下降，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。与糖尿病模型组比较，丝胶治疗组大鼠视网膜中ICAM-1和VCAM-1蛋白相对表达量均明显降低（0．8343±0．0321与0．9189±0．0424、0．7264±0．0112与1．2350±0．0789），而Cx43相对表达量明显升高（0．1331±0．0153与0．0392＋0．0020），差异均有统计学意义（均P〈0．05）。与正常对照组比较，糖尿病组大鼠视网膜中ICAM-1mRNA和VCAM-1mRNA相对表达量明显升高，而Cx43mRNA表达明显下降，差异均有统计学意义（均P〈0．05）；与糖尿病模型组大鼠比较，丝胶治疗组大鼠视网膜中ICAM-1mRNA和VCAM-1mRNA相对表达量明显下降（0．7163±0．0086与0．9568±O．0125；0．3937±0．0350与0．4779±0．0206），而Cx43mRNA表达明显升高（0．6768±0．0648与0．4308±0，1113），差异均有统计学意义（均P〈0．05），各组ICAM-1mRNA、VCAM-1mRNA和Cx43mRNA相对表达量的变化趋势与其蛋白表达相同。结论丝胶能够减轻糖尿病大鼠早期视网膜的微血管病变，从而对DR的发生和发展发挥防护作用，其机制可能是下调视网膜中ICAM-1和VCAM-1的表达以及上调Cx43的表达。

Cx43转基因自体成肌细胞移植对犬急性心肌梗死后心肌结构和心功能的影响

目的移植Cx43转基因自体成肌细胞（Cx43 SMC）到犬急性心肌梗死（AMI）区内，观察移植Cx43 SMC对心肌结构和心功能的影响。方法将24条健康杂种犬采用计算器随机法分为3组（n=8），即成肌细胞（SMC）移植组、Cx43 SMC移植组和对照组。取犬自体骨骼肌，经体外分离、培养和转化，将质粒载体pLenti6／V5-DEST-Cx43转入骨骼肌成肌细胞。利用结扎左前降支（LAD）的方法建立AMI动物模型，经LAD和梗死区多点注射的方法将实验组犬注射SMC或Cx43 SMC（细胞总数2×10^6个），对照组注射等量的细胞培养液。分别在AMI前1d、AMI后4周、细胞移植4周后，用超声心动图（UC／3）测量左室射血分数（LVEF）、左室舒张末期内径（LVDD）和左室收缩末期内径（LVSD）；并进行心肌组织的光镜和电镜的病理学检查。结果AMI前UCG检查犬左室形态和收缩功能正常，结扎LAD4周后，LVEF降低、LVDD和LVSD均增加（P〈0．05）。移植后4周，与对照组和移植前比较，SMC和Cx43 SMC移植组的LVEF升高、LVDD和LVSD减少（P〈0.05），其中Cx43 SMC移植组较SMC移植组为显著（P〈0．05）。组织病理学检查亦显示移入的Cx43 SMC在宿主心肌组织中排列有序，与宿主心肌细胞的排列方向一致，其间有闰盘形成。结论Cx43 SMC梗死区心肌移植后可减轻心室重构的进程，增加心肌的收缩力，改善心功能。

人真核表达的质粒载体pLenti6/V5-DEST-Cx43的构建及鉴定

目的构建人真核表达的质粒载体pLenti6/V5-DEST-Cx43,为研究连接蛋白Cx43在心肌细胞间通讯、心脏胚胎发育及心肌细胞分化中的作用机制提供物质基础。方法从质粒p18-T上用限制性内切酶BamH1、Xho1切下Cx43cDNA片断,进行琼脂糖电泳,割胶回收纯化;限制性内切酶BamH1、Xho1酶切质粒pENTR11,将线形化的载体与回收的Cx43cDNA片断用T4DNA连接酶连接,测序后通过LR反应克隆到慢病毒载体pLenti6/V5-DEST中。结果凝胶电泳和测序结果均证明已将人类Cx43cDNA克隆到慢病毒载体pLenti6/V5-DEST中。结论成功构建了人真核表达的质粒载体pLenti6/V5-DEST-Cx43。