庆大霉素对CIH子代大鼠听力及内耳Connexin26蛋白表达水平影响的研究

目的研究官内缺氧和庆大霉素（GM）双重影响对仔鼠内耳听力损伤影响的关系。方法建立宫内慢性缺氧（Intrauterine chronic hypoxia，CIH）孕鼠模型，24只SD孕大鼠分为正常组和缺氧组，每组12只。分娩后得正常仔鼠和缺氧仔鼠各12窝（每窝12-13只仔鼠）。仔鼠生后8周，随机选取正常仔鼠24只，分正常仔鼠组、正常＋GM仔鼠组；缺氧仔鼠24只，分缺氧仔鼠组、缺氧＋GM仔鼠组（各12只）。4组仔鼠做听性脑干反应（auditory brainstem response，ABR）检测听功能后，麻醉处死动物，取出内耳分别做Westernblot、实时定量PCR、亚硫酸氢盐测序法（BSP）甲基化检测等。结果孕鼠动脉血气分析：缺氧组孕鼠动脉血氧分压（PaO2）、动脉血氧饱和度（SaO2）水平和正常组比较，均显著下降，差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01），缺氧组孕鼠与正常组间PaCO2及pH值差异均无统计学意义（P〉0．05）。ABR检测结果：缺氧＋GM仔鼠组的ABR阈值明显高于其他3组，差异有统计学意义（P〈0．01）。正常＋GM仔鼠组、缺氧仔鼠组之间ABR阈值差异无统计学意义（P〉0．05），但正常仔鼠组ABR阈值均低于正常＋GM仔鼠组、缺氧仔鼠组，差异均有统计学意义（P〈0．05）。实时定量PCR检测仔鼠内耳组织GJB2mRNA水平：缺氧＋GM仔鼠组GJB2mRNA水平明显低于其他3组，差异有统计学意义（P〈0．01）。正常＋GM仔鼠组、缺氧仔鼠组之间的GJB2 mRNA水平差异无统计学意义（P〉0．05），但正常仔鼠组的GJB2mRNA水平均高于正常＋GM仔鼠组、缺氧仔鼠组，差异均有统计学意义（P〈0．05）。Westernblot检测仔鼠内耳Connexin26蛋白表达的结果和GJB2mRNA表达水平一致。甲基化测序：GJB2基因启动子岛1、岛2区域甲基化分析，缺氧＋GM仔鼠组内耳组织中的GJB2基因启动子区域岛1、岛2位点甲基化率百分比明显高于其他3组，差异有统计学意义（P〈0．01）。正常＋GM仔鼠组和缺氧仔鼠组的GJB2基因启动子区域岛1、岛2位点甲基化率百分比水平差异无统计学意义（P〉0．05），但和正常仔鼠组比较明显升高，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论妊娠期缺氧及GM可导致仔鼠听力损伤，并且有协同效应。主要是致聋基因GJB2基因启动子岛1、岛2区域甲基化水平上升，GJB2mRNA水平下降，Connexin26蛋白表达下降。

中国人常见GJB2基因突变表达载体的构建及鉴定

目的:构建中国人常见GJB2基因突变235de1C、299-300delAT和176de116bp与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白表达载体,寻找体外研究GJB2基因缺失突变致聋机制的有效途径。方法:用体外定点突变法构建235de1C、299-300delAT和176de116bp突变全序列与EGFP表达载体,以此为模板PCR扩增突变有效表达序列,将PCR产物连接到pMD19-T载体中,EcoRI/BamHI双酶切克隆载体,测序鉴定序列正确性后,将酶切产物插入pEGFP-N1载体中,脂质体转染HEK293细胞,荧光显微镜观察表达的融合蛋白。结果:GJB2基因突变235de1C、299-300delAT和176de116bp在HEK293细胞中高效表达,表达主要位于细胞质中。结论:成功构建了中国人常见GJB2基因突变235de1C、299-300delAT和176de116bp与EGFP的融合蛋白表达载体,为进一步研究其致聋机制奠定了基础。

抗GFP纳米抗体为亲和配基纯化缝隙连接蛋白26

[目的]以表达纯化的抗GFP纳米抗体为亲和配基制作免疫亲和层析柱纯化缝隙连接蛋白26(Cx26),为其他与GFP融合表达的膜蛋白的纯化提供新的思路。[方法]用大肠杆菌表达镍柱纯化抗GFP纳米抗体,以其为亲和配基Sepharose 4B琼脂糖为亲和介质,制作抗GFP纳米抗体免疫亲和层析柱,并用其纯化Cx26-GFP融合蛋白。通过激光共聚焦显微镜和荧光尺寸排阻色谱法(FSEC)检测层析柱与Cx26-GFP融合蛋白的结合能力、稳定性;SDS-PAGE凝胶电泳、尺寸排阻色谱法(SEC)观察目的蛋白Cx26的纯度及均一性。[结果]抗GFP纳米抗体免疫亲和层析柱在激光共聚焦显微镜下呈现圆形、无色、直径约30~80μm的琼脂糖球,与Cx26-GFP融合蛋白结合后琼脂糖球发出绿色荧光。过柱前的溶膜后上清和过柱后的流穿液1经FSEC分析显示,两个样品均在洗脱体积11.5 mL时出现Cx26-GFP融合蛋白峰,流穿液1在此位置处的峰高比溶膜后上清降低了86%。柱上酶切过夜去除GFP标签后的流穿液2经SEC分析显示洗脱体积15 mL时出现左半峰高耸右半峰增宽的Cx26蛋白峰;峰尖处收集管液经SDS-PAGE凝胶电泳分析在25 kDa附近观察到Cx26蛋白条带。[结论]表达纯化的抗GFP纳米抗体有生物学活性,以此制备的抗GFP纳米抗体免疫亲和层析柱可稳定结合Cx26-GFP融合蛋白并纯化出杂质少、性状均一的Cx26蛋白。