串联养殖模式下的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)与缢蛏(Sinonovacula constricta)生长特性、消化免疫及水生态效应

虾蛏串养模式作为海水围塘养殖坚持可持续发展、绿色发展的模式,已在福建沿海地区推广,取得明显效果,但目前适宜于该模式下的虾蛏数量配比尚不清楚。在实验室内,通过设立LP组(虾蛏数量配比1︰3)、MP组(1︰5)、HP组(1︰7),模拟虾蛏串联养殖模式,对虾和缢蛏分别投喂颗粒饲料、微绿球藻和角毛藻,并对虾蛏生长特性、养殖环境水质因子、消化与免疫指标、环境与蛏内脏团微生物群落进行探究。结果表明,LP组和MP组虾蛏增重率和特定生长率显著高于HP组。LP组和MP组对虾增重率分别为43.88%、41.91%,缢蛏增重率分别为29.30%、29.40%。水质营养盐浓度开始总体升高达到峰值后总体下降。虾蛏对环境反应不同,缢蛏中淀粉酶和过氧化氢酶活性变化显著,对虾则是胰蛋白酶和超氧化物歧化酶活性变化显著。RDA分析表明,总氮、活性磷酸盐是影响微生物群落关键因素。16S rRNA分析表明,虾蛏不同数量配比对养殖环境以及缢蛏内脏团有较大影响,与LP组相比,MP组和HP组微生物种类更多,且参与氮磷循环的微生物丰度增加。当虾蛏数量配比为1︰3或者1︰5时,虾蛏能良好生长且串养系统养殖环境能起到改善作用。研究结果有助于优化虾蛏串养模式,对今后虾蛏串养模式健康发展具有重要意义。

缢蛏(Sinonovacula constricta)耐氨氮关联SNP验证及相关基因NKA在氨氮胁迫下的表达特征分析

为筛查和验证缢蛏(Sinonovacula constricta)耐氨氮相关单核苷酸多态性(SNP)和基因,为分子标记辅助育种提供参考,通过竞争性等位基因特异性PCR(KASP)对位于缢蛏NKA基因(Sc-NKA)下游的SNP(g.21062868T>A)进行验证,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)检测高氨氮胁迫下Sc-NKA基因的表达水平,用免疫荧光技术对Sc-NKA蛋白进行组织细胞定位,通过RNA干扰探究Sc-NKA基因在氨氮排泄中的作用。结果显示,SNP位点(g.21062868T>A)与氨氮耐受性状显著相关(P<0.05);Sc-NKA基因在氨氮胁迫后的mRNA和蛋白表达量均显著增加(P<0.05);缢蛏鳃中的柱状细胞和扁平细胞是Sc-NKA蛋白分泌的主要部位,且在氨氮胁迫后细胞中的蛋白丰度增加;干扰Sc-NKA基因6~48 h后,缢蛏血淋巴中氨含量显著升高(P<0.05),且Na^(+)-K^(+)-2Cl共转运蛋白1(NKCC1)的mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。这些研究结果表明,Sc-NKA参与氨氮的排泄过程,且与NKCC1在氨氮转运中具有协同作用。

基于综合生物标志物响应指数评价0#柴油和平湖原油胁迫下的缢蛏（Sinonovacula constricta）毒性效应

选择0#柴油和平湖原油乳化液对缢蛏(Sinonovacula constricta)进行氧化胁迫实验,选取典型的抗氧化酶-超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷光甘肽硫转移酶(GST)及过氧化物酶(POD)用于衡量油类污染物对生物体造成的氧化压力大小.此外,结合综合生物标志物响应(Integrated Biomarker Responses,IBR)指标,对2种石油污染物对缢蛏的毒性响应进行定量化评价.结果表明,不同浓度的0#柴油和平湖原油对缢蛏消化腺中的4种酶表现出不同程度的诱导效应,各试验组在暴露前期均表现出诱导或抑制,但对4种酶的影响存在时间顺序性,SOD、CAT和GST的酶活性表现为升高-降低的过程,POD表现为降低-升高的过程,活性达到峰值的时间SOD和CAT要早于GST和POD.结合计算出的IBR数值来看,高浓度0#柴油能够引起最为显著的生物效应变化,显示该石油污染物高毒性的特征,0#柴油生物毒性大于平湖原油生物毒性.

温度、pH对缢蛏(Sinonovacula constricta)消化酶活力的影响

本文研究了温度、pH对缢蛏 (Sinonovaculaconstricta (Lamarck) )三种主要消化酶 (蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶 )活力的影响。结果表明 :当温度在 5～ 75℃之间时 ,蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶的最适温度分别为为 55℃、4 5℃和 6 5℃ ;在不同的pH范围内 ,蛋白酶的最适pH值为 9.2 ,淀粉酶的最适pH值为 6 .3和 7.7,纤维素酶的最适pH值为 5.2。缢蛏的淀粉酶和蛋白酶活力较大 ,纤维素酶活力极微。

缢蛏(Sinonovacula constricta)EST-SSR分布特征及引物开发利用

采用CAP3软件对NCBI上的5296条缢蛏ESTs序列进行了微卫星特征分析。结果表明,经拼接、去冗得到非冗余EST序列3453条,含SSR位点的EST序列267条,共307个SSR位点,检出率为8.89%,平均每6.83kb出现1个SSR位点。设计了40对EST-SSR引物并进行PCR扩增,29对引物能扩增出理想的PCR产物,其中多态性引物14对。利用14对多态性引物分析了乐清湾缢蛏遗传多样性,共检测到等位基因数(Na)61个,每个位点的等位基因数为2—12个。二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重复是最主要的重复类型,分别占15.96%、37.13%和35.50%。乐清湾缢蛏群体观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)分别为0.569、0.490和0.449,表明乐清湾缢蛏遗传多样性较丰富。

温度对缢蛏(Sinonovacula constricta)耗氧率和排氨率的影响

实验研究温度对不同个体大小缢蛏耗氧率和排氨率的影响。实验结果表明 ,在实验温度(15～ 30℃ )条件下 ,缢蛏的耗氧率 (O) [mg/ h·个 ]和排氨率 (N ) [μg/ h·个 ]与缢蛏软体部干重(W)呈明显的幂函数关系 ;温度的上升使得缢蛏的耗氧率 (OS) [mg/ g· h]、排氨率 (Na) [μg/ g· h]均增大 ;两者之间的比值 (原子数 O∶ N)在 2 0℃时最大 ,随着温度的继续升高其值逐步减小。耗氧率 (O)、排氨率 (N)与温度 (T)、缢蛏软体部干重 (W)二元线形回归方程分别是 :O=- 0 .370 3+0 .32 0 4 W+ 0 .0 2 98T,N =- 15 4 .0 6 77+ 6 9.74 88W+ 7.9332 T。复相关系数 r分别为 0 .9773和0 .92 2 8;F检验表明 ,两个回归方程均极显著。

缢蛏(Sinonovacula constricta)cDNA文库的构建及肌动蛋白基因的研究

采用SMART(switching metchanism at 5’end of RNA transcript)技术构建缢蛏cDNA基因文库。并对cDNA文库的滴度,重组率和插入片段的大小进行了检测。结果表明,该cDNA文库的滴度为5.50×104cfu/ml,重组率为92.5%,插入片段的长度大多在1kb以上。对478个克隆子进行了测序,共得到430个有效序列,其中166个序列无同源性,264条序列具有同源性。从中得到肌动蛋白(actin)cDNA的全长1538bp,开放阅读框(ORF)为1131bp,编码376个氨基酸,其预测蛋白的分子量为41.78kD,等电点为5.30。该氨基酸序列与其它物种的同源性大都在90%以上。

镉诱导缢蛏(Sinonovacula constricta)体内金属硫蛋白基因变化规律研究

采用荧光定量PCR法,研究了缢蛏体内7种组织中金属硫蛋白(MT)mRNA的组织特异性表达,以及不同浓度梯度重金属Cd2+对缢蛏内脏团中MT mRNA的诱导效应。结果表明,在自然状态下,MT mRNA在缢蛏内脏团中的相对表达量最高;在不同浓度重金属Cd2+胁迫条件下,缢蛏内脏团中MT mRNA的诱导表达具有明显的剂量效应和时间效应,即随着Cd2+浓度的增加,MT mRNA的最大表达量明显升高,而随着时间的变化,MT基因的表达呈现脉冲式波动,具有较强的时间依赖性。在3h和48h缢蛏内脏团中MT基因表达量与重金属Cd2+浓度之间具有较好的线性相关性,说明缢蛏内脏团中MT mRNA表达变化可以作为指示环境重金属Cd2+污染的一个生物参考指标。

缢蛏(Sinonovacula constricta)生化遗传特征分析

于 2 0 0 1年 4月 ,在浙江近海采集 1 0 0个缢蛏样品 ,采用聚丙烯酰胺垂直板不连续电泳方法 ,对缢蛏足、水管、消化腺、外套膜、鳃等 5种组织或器官进行了EST、ADH、MDH、IDH、ME、G6PDH、LDH、ALP、GDH、CAT、ALP、ACP、SOD、SDH、ATP、SUDH、GCDH、AMY、GAD、POD等 2 0种同工酶的电泳研究 ,并对各种酶的同工酶位点及酶谱表型进行了分析。结果表明 ,所测组织中未检出CAT、ALP、GCDH、GAD ;AMY和ACP只在消化腺中有表达 ;SUDH只在水管、鳃、消化腺中表达 ;所检测的酶均不同程度地表现出了组织差异。

黑暗条件下缢蛏(Sinonovacula constricta)对牟氏角毛藻(Chaeroeeros moelleri)和青岛大扁藻(Platymonas subcordiformis)的滤食效应

采取捕食者-猎物间捕食效应研究方法,研究了黑暗条件下缢蛏对牟氏角毛藻、青岛大扁藻的滤食效应。结果表明,缢蛏滤食牟氏角毛藻和青岛大扁藻的功能反应均属Holling-Ⅱ型,拟合的圆盘方程分别为Na=0.981×N0/1+0.00039×N0和Na=0.7949×N0/1+0.00636×N0;缢蛏自身密度对滤食牟氏角毛藻、青岛大扁藻功能反应影响的数学模型分别为E=0.985P-1.0256和E=0.778P-1.1819;缢蛏自身密度与牟氏角毛藻、青岛大扁藻藻浓度间的联合反应方程分别为Na=0.9663XP-0.1819×N0/1+0.00039×N0和Na=0.6182×P-0.1819×N0/1+0.00636XN0分析了缢蛏的滤藻速率、滤藻功能反应类型及滤藻效应特征。

缢蛏ABC转运蛋白基因家族成员全基因组鉴定及表达模式分析

腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP binding cassette transporter,ABC transporter)家族是最古老的膜蛋白家族之一,广泛存在于原核生物和真核生物体内,利用ATP水解释放的能量对氨基酸、脂质、抗生素等物质进行跨膜运输,参与生物体内多种生理活动。目前,对软体动物ABC转运蛋白家族的鉴定,仅在虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)和长牡蛎(Crassostrea gigas)3种双壳类中有系统研究,对缢蛏(Sinonovacula constricta)ABC转运蛋白家族的鉴定和表达模式分析尚未见报道。利用缢蛏基因组和转录组数据,运用本地及NCBI在线BLAST程序、FGENESH+、SMART、Ex PASy、MEGA X、Mev 4.90和MapInspect等生物信息学分析工具,在全基因组水平系统地鉴定出52个缢蛏ABC转运蛋白,并对转运蛋白基因外显子数目、染色体定位等信息进行分析;通过系统进化分析,将缢蛏ABC转运蛋白家族分为8个亚家族,即ABCA~ABCH;通过比较分析不同物种ABC转运蛋白家族,推测基因串联复制事件对软体动物ABC转运蛋白家族成员数目的增加有影响。ABC转运蛋白基因在缢蛏不同发育时期和组织的表达分析显示,ABCC和ABCG亚家族多个基因在缢蛏稚贝时期表达量达到最高值,ABC转运蛋白基因在鳃、肝胰腺和性腺中表达种类较多。软体动物作为第二大动物类群,目前仅有3个物种的ABC转运蛋白得到了系统分类,缢蛏ABC转运蛋白基因家族的系统鉴定与表达模式分析为研究软体动物ABC转运蛋白基因的进化和缢蛏ABC转运蛋白功能提供了基础资料。

缢蛏(Sinonovacula constricta)微卫星标记的分离及近缘物种通用性

采用磁珠富集和PCR筛选相结合的方法,得到12对缢蛏(Sinonovacula constricta)的多态性微卫星引物。每个位点的观测等位基因数为2—15个,有效等位基因数为1.0339—8.8063个;观测杂合度(Ho)为0.0333—1.0000,平均观测杂合度为0.7525;期望杂合度(He)为0.0333—0.9020,平均期望杂合度为0.6866;多态信息含量(PIC)为0.0320—0.8680。所有位点中,有8个位点属于高度多态位点(PIC>0.5),SC1-5和SC4-6属于低度多态位点(PIC<0.25);经Bonferroni校正后,无显著偏离哈迪-温伯格平衡的位点;连锁不平衡检验结果表明,位点间不存在连锁不平衡现象。此外,分析了这些引物在近缘种长竹蛏(Solen strictus)、大竹蛏(Solen grandis)和小刀蛏(Cultellus attenuatus)的通用性情况,结果显示:长竹蛏中,位点SC1-4、SC2-8、SC3-1、SC3-14表现出了高度多态(PIC>0.5);在大竹蛏中,位点SC3-4、SC3-7、SC4-6表现出了高度多态性(PIC>0.5),SC2-9为低态位点(PIC<0.25);在小刀蛏中,位点SC1-7、SC2-9、SC3-4、SC3-14表现出了高度多态性(PIC>0.5),SC4-6为低态位点(PIC<0.25)。

两种有机磷农药对缢蛏(Sinonovacula constricta)鳃超微结构的影响

在实验室模拟缢蛏生长环境,研究结构、性质不同的两种典型有机磷农药(OPs)乐果和三唑磷对滩涂养殖生物缢蛏的毒性效应,通过电镜观察乐果和三唑磷对缢蛏鳃超微结构的影响。结果发现:乐果和三唑磷对缢蛏鳃超微结构的影响主要表现在对细胞核和各种细胞器(如线粒体、内质网、高尔基体)的伤害。主要病变为:细胞核变形,核膜凸起或凹陷,染色质发生凝聚或边缘化;线粒体肿大,双层膜溶解,内嵴部分消失;个别线粒体内嵴完全瓦解,形成电子透明区;粗面内质网水肿,核糖体部分脱落,片层结构间距增大;高尔基膜囊水肿,膜溶解,高尔基小泡破裂消失。本研究为了解不同OPs对缢蛏的毒性效应提供了病理形态学证据,为预测OPs对近海海洋生物及人类健康的影响提供有力的证据,为规范OPs的应用、制定海洋环境质量标准提供了部分基础理论依据。

有机磷农药对缢蛏[Sinonovacula constricta (Lamarck)]显微结构的影响

在实验室模拟缢蛏的生长环境,研究乐果和三唑磷对缢蛏的毒性效应.以气相色谱法测定缢蛏体内有机磷农药的含量,并通过光镜观察有机磷农药对缢蛏鳃和消化腺显微结构的影响.结果表明:缢蛏体内乐果和三唑磷的含量随着水体中有机磷农药的增加而增加,有很好的剂量-效应关系,但是无线性相关性.乐果和三唑磷对缢蛏鳃显微结构的影响是:鳃丝变短,鳃丝间隔和基底膜结缔组织增生,鳃孔、血管腔堵塞;不同的是:在乐果胁迫下,上皮细胞纤毛脱落严重,而三唑磷胁迫下,上皮细胞纤毛增生.乐果和三唑磷对缢蛏消化腺显微结构的影响主要表现为腺细胞界限模糊,腺泡水肿变形、部分坏死;结缔组织增生,细胞间质疏松,出现许多空泡;有机磷农药的浓度高时消化腺细胞变性、坏死,细胞质囊泡化.

缢蛏(Sinonovacula constricta)EST-SSR标记与生长性状的相关性分析

利用16个微卫星标记对缢蛏F1家系的遗传多样性和标记-性状相关性进行了研究。结果显示,16个SSR位点共检测到39个等位基因,平均等位基因数(Na)和平均有效等位基因数(Ne)分别为2.44和2.09;多态信息含量(PIC)为0.40;平均观测杂合度(Ho)与期望杂合度(He)分别为0.58和0.63,部分位点基因型分布严重偏离孟德尔定律,暗示其可能与适应性基因相连锁,其中YC-8位点附近可能存在杂合不利存活基因。位点YC-96和YC-123与体重呈显著相关(P<0.05),YC-96的BC基因型和YC-123的BB基因型均为体重性状的优势基因型,其对应的壳长、壳宽、壳高和体重4个生长性状表型值都最大,可以作为选育快长性状的候选分子标记;YC-1位点与壳宽呈显著相关(P<0.05),其中BB型是壳宽的优势基因型;YC-93位点与壳宽、壳高呈极显著相关(P<0.01),其中AB型是壳高的优势基因型,BB和BC型是壳宽的优势基因型。对YC-1、YC-93、YC-96和YC-123进行以体重性状为参照的不同基因型组合比较,找到了最优组合(BB/BB(BC)/BC/BB),与4个位点单独分析对应的最优基因型基本完全一致,符合加性作用模型。筛选出的与生长性状相关的标记可为标记辅助选择育种(MAS)提供参考依据。

有机磷农药对缢蛏(Sinonovacula constricta)消化腺超微结构的影响

在实验室模拟缢蛏生长环境,研究结构、性质不同的两种典型有机磷农药(OPs)乐果和三唑磷对滩涂养殖生物缢蛏的毒性效应,通过电镜观察乐果和三唑磷对缢蛏消化腺超微结构的影响.结果发现,乐果和三唑磷对缢蛏消化腺超微结构的影响相似,主要表现在对腺细胞的细胞核和各种细胞器(如线粒体、内质网、高尔基体)的伤害.主要病变为:细胞核变形,核膜或凸起或凹陷,染色质发生凝聚或边缘化;线粒体肿大,双层膜溶解,内嵴部分消失;个别线粒体内嵴完全瓦解,形成电子透明区;粗面内质网水肿,核糖体部分脱落,片层结构水肿、囊泡化,严重者出现大的囊泡区.本研究为了解不同OPs对缢蛏的毒性效应提供了病理形态学证据.

缢蛏(Sinonovacula constricta)对海水中镉富集规律的研究

论文利用微波消解-石墨炉原子吸收法,研究在不同Cd2+浓度(0.005 mg·L-1、0.025 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.1 mg·L-1)暴露下缢蛏对水体Cd2+的富集规律。结果表明,缢蛏对重金属Cd2+有一定的富集能力,其软体组织对Cd2+的富集量、富集速率随暴露剂量增加而升高,并在168 h的暴露时间内,体内Cd含量及其富集倍数(BCM)与暴露时间呈显著的正相关关系(P<0.01);缢蛏不同组织对Cd的富集能力(富集量、富集速率、富集倍数)存在显著差异,其消化腺、鳃和肌肉组织对Cd富集能力的大小表现为:消化腺>鳃>肌肉。与其他贝类对Cd的富集情况相比,缢蛏不是Cd的强净积累者。

乐清产缢蛏(Sinonovacula constricta)肉营养成分的研究

就缢蛏(Sinonovacula constricta)的营养成分进行了分析。用干燥法、凯氏定氮法、灼烧法、酸水解法、蒽酮比色法等方法,分别对其水分、蛋白质、灰分、脂肪、碳水化合物等营养成分作了测定。结果显示:水分、蛋白质、灰分、脂肪、碳水化合物占缢蛏肉百分比分别为85.56%,10.16%,2.82%,0.55%,0.93%。经比较,本实验缢蛏中的蛋白质成分高于其它地区。说明乐清产缢蛏是一种高蛋白、低脂肪,富含灰分的海味佳品。

高分辨质谱技术分析两地缢蛏的脂质差异性

目的基于高分辨质谱技术对浙江象山和福建云霄两大主产地缢蛏的脂质差异性进行比较。方法样品经培养后,去壳、去胃进行冷冻干燥,采用脂类提取法提取,以Hypersile Gold C18(100 mm×2.1 mm,1.9μm)色谱柱为分析柱,甲醇/水(A)、甲醇/异丙醇(B)为流动相进行梯度洗脱分离,采用四极杆静电场轨道阱高分辨质谱法对缢蛏脂质进行定性和半定量分析。结果两大主产地缢蛏均检测到脂质78种,潜在生物标记物由磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)、神经酰胺氨乙基亚磷酸(ceramide aminoethyl phosphite,CAEP)、甘油三酯(triglyceride,TAG)和甘油二酯(diglyceride,DAG)组成。浙江象山产地的缢蛏PE(17:1-22:6,15:1-22:6,16:1-22:6,17:1-18:4)、PI(20:3-20:5)和DAG(18:4-18:4)含量为福建云霄产地的2.55~9.11倍;福建云霄产地的缢蛏DAG(16:0-16:0)、CAEP(d18:2-n16:0)和PI(16:0-20:5)含量是浙江象山产地的2.79~2.90倍。结论浙江象山和福建云霄产地的缢蛏存在脂质差异性,为其产地鉴定提供重要依据。

缢蛏(Sinonovacula constricta)规模增殖放流对三沙湾滩涂底质环境改良的效果

于2013—2014年在三沙湾选择增殖放流区Ⅰ区和Ⅱ区,开展了2批次的缢蛏增殖放流,计放流缢蛏苗数量约3747万粒。采用对缢蛏生长、生物量动态变化和滩涂底质主要因子跟踪监测的方法,开展对缢蛏增殖放流效果的评估。研究结果,2个增殖放流区的缢蛏密度和缢蛏生物量都比对照区有极显著提高,共收获65吨缢蛏大规格苗,增殖放流产出比为1:8.0—9.0,获得了一定的资源增殖效果和经济效益。放流期间,滩涂底泥中的氧化还原电位、硫化物和有机碳等浓度在增殖区Ⅰ区、Ⅱ区和对照区之间都无显著差异(P>0.05),但,底泥中Ⅰ区、Ⅱ区的氧化还原电位平均值分别比对照区提高了26%和18%,硫化物浓度平均值分别比对照区降低了45%和34%,有机碳浓度平均值分别比对照区下降了5.8%和6.8%,表明,缢蛏增殖放流获得了一定的改良底质环境效果。