Copines蛋白家族在肾透明细胞癌中的潜在预后价值

目的探讨Copines蛋白家族(CPNEs)在肾透明细胞癌(KIRC)中的潜在预后价值。方法在GEPIA、HPA、Kapian-Meier Plotter、cBioPortal GeneMANIA、STRING、TIMER2.0等数据库中对KIRC患者的CPNEs表达差异、生存预后、临床分期、基因突变、蛋白互作、免疫浸润等数据进行生物信息学分析和整理。结果CPNE1、CPNE2、CPNE5、CPNE7、CPNE8在KIRC组织中表达水平均显著升高(P<0.05),CPNE3、CPNE4、CPNE6在KIRC组织中表达水平均显著降低(P<0.05),CPNE1、CPNE3、CPNE7的mRNA的表达水平与KIRC的临床分期明显相关(P<0.05)。高表达CPNE1、CPNE7的KIRC患者的总体生存率(OS)明显低于低表达的患者(P<0.05),低表达CPNE3、CPNE6的KIRC患者的OS明显低于高表达的患者(P<0.05)。此外,差异表达的CPNEs的功能主要依赖于钙依赖性磷脂结合蛋白参与的信号通路的跨膜运输和与蛋白质的相互作用。CPNEs在KIRC中的表达与多种免疫细胞的浸润显著相关,包括B细胞、CD8^(+)T细胞、CD4^(+)T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等6种类型。结论CPNE1、CPNE3、CPNE7可能是KIRC预后潜在的生物标志物。

Copine7蛋白在牙、牙周组织发育与再生中的作用

Copine 7(CPNE7)蛋白是在前成釉细胞条件培养基(preameloblast⁃conditioned medium,PACM)中发现的一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白。在牙发育过程中,CPNE7蛋白由牙源性上皮细胞表达并分泌,参与调控牙源性间充质细胞向成牙本质细胞分化。近年研究发现,CPNE7蛋白可促进第三期牙本质的形成和牙本质小管内矿物沉积,降低牙本质通透性,在牙本质损伤修复方面有重要的临床应用前景。此外,CPNE7蛋白可促进牙骨质的形成,但与牙周膜的形成无明显关系。本文对CPNE7蛋白在牙本质和牙周组织发育中的作用及其机制作一综述,以期为相关疾病的治疗提供新的思路和方向。

N-copine基因反义核酸对原代培养的小鼠皮质神经元的影响

目的:通过研究N-copine基因反义核酸(antisense)对体外培养的小鼠大脑皮质神经元的影响,在细胞学层面上探索N-copine基因的功能。方法:原代培养小鼠大脑皮质神经元,用反义核酸抑制N-copine基因的表达,分析抑制N-copine基因表达对神经元生长及死亡的影响。结果:寡核苷酸处理72h,antisense组神经元轴突长度短了而且胞体变小,而对照组神经元轴突和胞体都正常生长;antisense组台盼蓝着色细胞明显多于对照组,培养液中LDH活力明显高于对照组。结论:抑制N-copine基因表达,能影响体外培养的皮质神经元的生长,并导致神经元严重损伤和死亡。这提示N-copine可能是神经元的一种保护性蛋白,可能具有防止神经元退变和促进再生的重要作用。

copine Ⅴ蛋白的亚细胞定位

目的:确定copineⅤ蛋白的亚细胞定位,初步研究该蛋白的生物学功能。方法:将copineⅤ编码区基因分别构建真核表达载体pEGFP-copineⅤ(或pRED-copineⅤ),转染HEK293、HeLa细胞,在激光共聚焦荧光显微镜下与转染空载体pEGFP-N1(或pRED-N1)的细胞比较观察。结果:经限制性内切酶分析鉴定,构建的重组表达载体正确。通过激光共聚焦荧光显微镜观察,转染了重组载体pEGFP-copineⅤ的细胞荧光信号集中分布于胞膜和内膜系统;进一步研究表明copineⅤ定位于内质网而非线粒体,而空载体则在整个细胞中均匀分布。结论:copineⅤ蛋白定位于细胞膜和内质网上,而不定位于线粒体。

外源表达的人copine Ⅴ诱导细胞死亡的研究

目的:copines蛋白家族是新近发现的一类分布广泛、进化保守的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,copineⅤ是其成员之一。为研究copineⅤ基因的功能,构建了人copineⅤ基因的真核表达质粒并转染HEK293细胞,以进一步研究其功能。方法:构建人copineⅤ编码区序列的真核表达质粒pCDNA4/copineⅤ,脂质体法转染HEK293细胞。通过RT-PCR、克隆形成实验和Hochesst33342染色等方法观察copineⅤ基因对HEK293细胞生长的影响。结果:外源表达的人copineⅤ可以诱导HEK293细胞死亡,无法筛选到稳定克隆。结论:人copineⅤ可以诱导HEK293细胞死亡,为进一步研究copineⅤ基因的生物功能提供了线索。

siRNA沉默CPNE7基因表达抑制人牙周膜细胞的增殖及骨向分化

目的 :探讨沉默CopineⅦ(CPNE7 si RNA)对人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,h PDLs)增殖及骨向分化的作用及其可能机制。方法:体外分离培养h PDLs,采用脂质体转染法将沉默CPNE7的质粒p SUPER-CPNE7转染至h PDLs。采用RT-PCR和Western印迹法检测CPNE7的表达,ELISA检测CPNE7 si RNA对NF-κB活性的作用。给予10μmol/L NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代甲酸铵盐(pyrrolidinedithiocarbamic acid ammonium salt,PDTC)预处理h PDLs 30 min,采用CCK8检测CPNE7对细胞增殖的影响,ELISA检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,RT-PCR和Western印迹法检测RUNX2、OSX和OCN的表达。采用SPSS11.0软件包对数据进行统计学分析。结果:h PDLs经转染p SUPER-CPNE7,CPNE7表达下调,有显著性差异(P<0.05)。CPNE7 si RNA显著增强NF-κB的活性。与对照组(CON)相比,CPNE7 si RNA显著抑制h PDLs增殖,下调ALP活性及RUNX2、OSX和OCN的表达,给予PDTC促进h PDLs增殖,增强ALP活性并上调RUNX2、OSX和OCN的表达。结论 :CPNE7 si RNA通过NF-κB通路抑制h PDLs增殖和骨向分化。

下调CopineⅠ抑制缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡

目的研究CopineⅠ(CPNE1)对缺氧/复氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)诱导H9c2细胞凋亡的作用及可能的机制。方法以H9c2心肌细胞为研究对象,建立H/R模型,细胞被随机分为对照组(CON)、H/R组、阴性对照(NC)+H/R和CPNE1 siRNA+H/R组,阻断实验用NF-κB的阻断剂PDTC(10μmol/L)预处理细胞30 min。RT-PCR和Western blot方法用于检测CPNE1表达水平。细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性采用ELISA方法检测。细胞经AnnexinV/PI染色后用流式细胞仪检测凋亡率,Western blot方法检测claved-caspase3(c-caspase3)、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。细胞中NF-κB活性采用ELISA方法检测。结果与CON组相比,H/R组CPNE1表达水平上调、LDH活性升高、凋亡率上升、c-caspase3和Bax蛋白表达升高、Bcl-2蛋白表达水平下降。与NC+H/R组相比,CPNE1 siRNA+H/R组细胞的LDH活性下降、凋亡率降低、c-caspase3和Bax蛋白表达减少、Bcl-2表达增多。此外,沉默CPNE1细胞核中NF-κB活性增强且蛋白表达上升,PDTC可逆转CPNE1 siRNA对细胞凋亡的抑制作用。结论下调CPNE1的表达能够抑制H/R诱导的H9c2细胞凋亡,其可能机制是通过增强NF-κB活性发挥心肌保护作用。

Copines蛋白家族的研究进展

Copines蛋白家族是新近发现的一类分布广泛、进化保守的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,它们的结构特征为:N端有2个C2结构域,与突触结合蛋白(synaptotagmin)和蛋白激酶C的C2结构域不但高度同源,而且同样具有Ca2+依赖性的磷脂结合功能;C端有1个A结构域,与整合蛋白A结构域部分同源,是蛋白与蛋白相互作用的结构域。近年来研究表明,Copines家族成员与细胞的膜转运、胞内信号转导、肿瘤发生等重大生物过程都密切相关。

茶树Copine家族基因CsBON3的克隆与表达分析

Copine蛋白是一类包含2个C2(N端)和1个vWA(C端)保守域的Ca^(2+)依赖蛋白或磷脂结合蛋白,在胞内信号转导中发挥重要作用。基于序列相似性分析,从茶树转录组数据库中筛选出1条与Copine家族基因高度同源的EST序列。经测序验证该序列包含1 746 bp的完整ORF,编码581个氨基酸。同源比对显示该基因与拟南芥At BON3序列相似度最高(65%),将其命名为CsBON3(Gen Bank登录号为KY435900)。生物信息学分析显示,CsBON3蛋白分子量为63.66 k D,理论等电点为5.48;具有Copine家族蛋白特有的保守结构域;属亲水性蛋白,无信号肽位点,非分泌性蛋白,无跨膜结构域。表达分析表明,CsBON3在茶树花和根系中表达量最高,茎干和成熟叶中表达量最低。低温(4℃)处理茶树1 d后,其表达被显著上调;在生长阶段,该基因表达量高于休眠阶段;同时在接种炭疽菌的茶树叶片中,该基因也被快速上调,表明该基因可能与茶树低温、生长发育及抗病相关。

copine 8在胰腺癌增殖、侵袭转移和凋亡中的作用研究

目的探究copine 8在胰腺癌中的生物学功能。方法利用GEO数据库比较copine 8在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达差异,利用The Cancer Genome Atlas(TCGA)胰腺癌患者组织RNA测序数据库分析其对总体生存率的影响,并对高copine 8表达组和低copine 8表达组的差异基因进行GO、KEGG富集分析和GSEA分析。利用siRNA干扰胰腺癌细胞系CFPAC-1和AsPC-1中copine 8的表达,CCK8实验和集落形成实验检测细胞增殖能力变化,Transwell实验检测细胞侵袭转移功能的变化,使用Annexin V-FITC和碘化丙啶分析凋亡细胞比例。结果copine 8 mRNA和蛋白均在胰腺癌组织中高表达,在癌旁组织中低表达,且与患者生存预后相关(P=0.033)。富集分析发现copine 8在胰腺癌中会影响WNT、Hippo、mTOR和ERBB信号通路,可能通过影响Hippo通路中关键分子YAP1、STK3、STK4和SGMS1的表达从而影响胰腺癌的进展。干扰copine 8表达后,胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力显著降低,且凋亡细胞比例明显增加。结论copine 8在胰腺癌增殖、侵袭转移和凋亡过程中有显著作用,有较强的促癌效应。

细胞外钙离子内流上调原发性开角型青光眼患者小梁网细胞Copine1表达的研究

目的探讨原发性开角型青光眼患者(primary open-angle glaucoma,POAG)小梁网细胞外钙离子内流对膜蛋白copine1表达的影响。方法原代培养POAG患者小梁网细胞,应用荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度,所用钙离子荧光探针为Fluo 3-AM;;应用钙离子运载剂A23187增加细胞内钙离子浓度;;应用Real-time PCR检测小梁网细胞内钙离子浓度增加前后copine1在转录水平的表达。结果经免疫组织化学鉴定培养的细胞为小梁网细胞。荧光显微镜下观察与流式细胞仪定量结果均显示,应用钙离子运载剂A23187增加了POAG患者小梁网细胞内的钙离子浓度。Real-time PCR检测证实A23187的应用使copine1 mRNA在小梁网细胞中表达增加了(1.8±0.3)倍。结论 POAG患者小梁网细胞内钙离子浓度增高可引起copine1在转录水平表达的上调,copine1在小梁网细胞中的功能研究将会增加对POAG病理学机制的理解,有助于新药物靶点的开发。

外源表达人CPNE5诱导细胞内质网应激反应

目的:探讨外源表达人CPNE5诱导细胞发生内质网应激反应的机制。方法:分别转染空载体pcDNA4和人CPNE5编码区序列的真核表达质粒pcDNA4-CPNE5至HEK293细胞,48 h后收集细胞,通过RT-PCR、Western印迹检测基因mRNA及蛋白的表达。结果:外源表达人CPNE5蛋白可以上调内质网应激特征分子GRP78、CHOP、JNK1基因的表达。结论:外源表达人CPNE5可以诱导HEK293发生内质网应激反应。

1,4-苯醌抑制人骨髓间充质干细胞中copine 1、copine 3的表达

目的建立人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)体外培养系统,检测1,4-苯醌(1,4-BQ)对hBM-MSCs中copine 1、copine 3表达的影响。方法采用密度梯度离心和流式细胞技术分离、鉴定hBM-MSCs;10、25、50μmol/L1,4-BQ染毒24 h后,实时定量PCR技术和蛋白免疫印迹检测hBM-MSCs中copine 1、copine 3 mRAN和蛋白质表达情况。结果 hBM-MSCs稳定表达CD29、CD44,几乎不表达CD34、CD45;实时定量PCR的结果证实,在mRNA水平1,4-BQ染毒剂量在10μmol/L即可引起copine 1表达降低,25μmol/L可引起copine 3表达水平降低。蛋白免疫印迹试验结果证实1,4-BQ为25μmol/L和50μmol/L分别引起copine 1和copine 3表达降低。结论 1,4-BQ可在转录水平和蛋白质水平抑制hBM-MSCs中copine 1和copine 3的表达,本研究结果有助于进一步阐明苯及其代谢物1,4-BQ的血液毒性机制。

毛果杨copine/BONZAI基因家族全基因组鉴定与组织表达特异性分析

利用copine蛋白保守序列进行blastx同源比对,鉴定毛果杨copine/BONZAI基因家族,构建系统进化树;通过在线网站进一步分析毛果杨copine蛋白的理化性质、结构和功能。利用数据库数据对copine/BONZAI基因在根、茎和叶等组织器官中的表达模式进行分析。结果显示,毛果杨含有3个copine/BONZAI基因,分别为PtBON1、PtBON2和PtBON3,氨基酸残基数分别为573 aa、576 aa、579 aa;相对分子质量分别为62865.57、63191.81、63980.64 kD;平均理论等电点分别为5.38、5.33、5.99。PtBONs具有明显的疏水区和亲水区,没有Coil区,N端不存在信号肽,不具有跨膜结构域,均为非分泌蛋白。PtBONs二级结构中最主要的结构元件是α-螺旋和无规则卷曲。通过STRING和KEGG预测copine蛋白参与了植物与病原体相互作用过程。本研究结果为今后研究杨树copine蛋白的细胞信号转导通路机制及温度介导的抗病调控机制等提供理论依据。

Copines蛋白家族在恶性肿瘤中的研究进展

据2019年世界卫生组织(world health organization,WHO)统计,恶性肿瘤是目前112个国家人口的第一或第二大死因^([1]),以及23个国家人口的第三或第四大死因[1]。WHO最新全球癌症报告显示,2020年全球估计有1930万例新发癌症病例(不包括非黑色素瘤皮肤癌)和近1000万例因癌症死亡,预计到2040年,全球癌症患者将达到2840万例,比2020年增加47%。