中国黄连组织和细胞培养条件的研究 Ⅱ.不同激素配比对培养物生长和小檗碱含量的影响

以中国黄连细胞无性系为材料,在6,7—V固体和液体培养基的基础上进行不同激素配比试验,结果为:(1)在固体培养基含KT0.1mg/L的条件下,添加2,4—D1.0～4.0mg/L能使培养物生长旺盛,2,4—D浓度再增大,生长减慢,白化透明细胞增多,小檗碱合成受到抑制;液体悬浮培养的2,4—D浓度大于1.0mg/L时,培养物干重及小檗碱含量随着2,4—D浓度的增大而下降。固体培养添加NAA1.0～10.0mg/L能提高培养物干物质积累和小檗碱含量,液体悬浮培养的NAA浓度大于1.0mg/L时,细胞培养物的小檗碱含量随着NAA浓度的增大而下降。(2)在培养基含2,4—D1.6mg/L的条件下,固体培养以添加KT或BA0.1mg/L的培养物干重和小檗碱含量为高,液体悬浮培养物的小檗碱含量则随KT或BA浓度(0.01～1.00mg/L)的增大而提高。在固体培养方式下对培养物生长和小檗碱积累较为有利的激素配比为KT0.1mg/L+NAA2.0～4.0mg/L;在液体悬浮培养方式下对培养物生长和小檗碱积累较为有利的激素配比为KT0.01mg/+NAA1.0mg/L。

L-酪氨酸对中国黄连细胞小檗碱合成的影响

接种前附加1.0～12.0mg/L L-酪氨酸于含有2.0mg/L NAA和0.1mg/LKT的6,7-V固体培养基中,可使中国黄连细胞的小檗碱含量和小檗碱积累分别比对照(未添加)增加56.21～84.62％和58.22～107.59％。接种后5～15天添加4.0mg/L L-酪氨酸于含有2.0mg/L NAA和0.1mg/L KT的液体培养基中,可使小檗碱含量和小檗碱积累分别比对照增加22.69～42.55％和25.82～50.21％。添加L-酪氨酸于含2,4-D的培养基中反而抑制小檗碱的合成。

中国黄连组织和细胞培养条件的研究 Ⅲ、接种量、材料日龄对培养物生长和小檗碱积累的影响

以中国黄连细胞无性系为材料,在6,7—V固体和液体培养基的基础上进行不同激素配比试验,结果为:(1)在固体培养基含KT0.1mg/L的条件下,添加2,4—D1.0～4.0mg/L能使培养物生长旺盛,2,4—D浓度再增大,生长减慢,白化透明细胞增多,小檗碱合成受到抑制;液体悬浮培养的2,4—D浓度大于1.0mg/L时,培养物干重及小檗碱含量随着2,4—D浓度的增大而下降。固体培养添加NAA1.0～10.0mg/L能提高培养物干物质积累和小檗碱含量,液体悬浮培养的NAA浓度大于1.0mg/L时,细胞培养物的小檗碱含量随着NAA浓度的增大而下降。(2)在培养基含2,4—D1.6mg/L的条件下,固体培养以添加KT或BA0.1mg/L的培养物干重和小檗碱含量为高,液体悬浮培养物的小檗碱含量则随KT或BA浓度(0.01～1.00mg/L)的增大而提高。在固体培养方式下对培养物生长和小檗碱积累较为有利的激素配比为KT0.1mg/L+NAA2.0～4.0mg/L;在液体悬浮培养方式下对培养物生长和小檗碱积累较为有利的激素配比为KT0.01mg/+NAA1.0mg/L。

黄连细胞培养物中小檗碱的分离与鉴定

用黄连幼叶切块，接种在含１０～２．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ和０１ｍｇ／ＬＫＴ的６，７Ｖ固体培养基上，诱导形成愈伤组织。选择较松散的愈伤组织转入液体悬浮培养，获得游离细胞和细胞聚集体。通过平板培养和细胞株的筛选，选择小檗碱含量较高的细胞株。经３５次转代培养后，进行固体、液体培养，收集悬浮培养细胞进行化学提取和分离，获得黄色晶体，经ＴＬＣ、ＵＶ、ＩＲ、ＭＳ鉴定分析为小檗碱。

蔗糖和硝酸铵对黄连悬浮培养细胞生长和小檗碱含量的影响

在６、７－Ｖ液体培养基中较为适合黄连细胞生长的蔗糖浓度为．３％，当蔗糖浓度增加到７％时，细胞生长速率开始下降，但小檗碱含量提高到５．２０％．小檗碱产率为４５６．６０ｍｇ／Ｌ（２３天）。基本培养基中随着补加ＮＨ４ＮＯ３浓度的增加，抑制细胞生长愈严重；补加０．８ｇ／ＬＮＨ４ＮＯ３的小檗碱含量比未加的增加约１０％，随着浓度的增加又急剧下降。