CTGF对角膜成纤维细胞生物学功能的影响

目的 观察结缔组织生长因子(CTGF)对体外培养的角膜成纤维细胞增殖、向肌成纤维细胞转化和合成细胞外基质的影响。 方法 体外培养兔角膜成纤维细胞,经0.5、5、50和500 ng／mL CTGF处理24 h后,分别进行增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色、银染核仁组成区染色(AgNOR)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫组化染色以及Ⅲ型胶原(CA-Ⅲ)、纤维连接蛋白(FN)和层黏蛋白(LM)免疫组化染色,检测CTGF对角膜成纤维细胞增殖、向肌成纤维细胞转化和细胞外基质合成的影响。 结果 与对照组相比,0.5、5、50和500 ng／mL的CTGF能剂量依赖性地促进角膜成纤维细胞PCNA表达,增加核仁银染颗粒数,促进α-SMA的表达,同时能促进角膜成纤维细胞CA-Ⅲ、FN和LM的合成(P<0.01)。结论 一定质量浓度的CTGF可能在角膜损伤修复过程中发挥重要作用。

多西环素对体外培养的牛角膜肌成纤维细胞增生的影响

背景 多西环素是一种金属离子螯合剂和广谱抗生素,常用于眼表疾病的治疗. 目的 研究多西环素对体外培养的牛角膜肌成纤维细胞增生的影响,并探讨其作用机制.方法 收集6只新鲜牛角膜,分别用基础培养液配制的1.0g/L及2.0 g/L Ⅰ型胶原酶对牛角膜基质层进行二步法消化分离,制成细胞悬液后转入培养瓶中用RPMI-1640培养液（含质量分数10％胎牛血清）进行培养.取生长良好的细胞进行波形蛋白免疫细胞化学染色以确定所培养的细胞来自角膜基质层,在细胞传代培养的同时进行α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫荧光细胞化学染色,呈阳性表现的细胞为角膜肌成纤维细胞.细胞培养36 h后培养液中不加入任何药物者为阴性对照组,阳性对照组细胞培养液中加入120 mg/L地塞米松,另分别在培养液中加入10、20、40、60、80 mg/L多西环素作为药物干预组.采用MTT比色法、流式细胞术测定各组干预24 h和48 h后角膜肌成纤维细胞的增生情况及细胞周期各时相的分布. 结果 体外分离培养的牛角膜肌成纤维细胞生长良好,免疫组织化学染色显示波形蛋白和α-SMA呈阳性反应,证实为角膜肌成纤维细胞.MTT比色法检测显示,随着多西环素质量浓度的增加,活性角膜肌成纤维细胞的数量逐渐下降,差异有统计学意义（F质量浓度=1233.778,P＜0.001）；随着药物作用时间的延长,活性角膜肌成纤维细胞的数量逐渐下降,差异有统计学意义（F时间=227.564,P＜0.001）；且两因素间的交互效应亦有统计学意义（F交互作用=51.656,P＜0.001）.流式细胞术细胞周期分析显示,10、20、40、60、80 mg/L多西环素作用24 h,G0-G1期角膜肌成纤维细胞率分别为82.85％、84.36％、85.18％、87.12％、89.31％,明显高于阴性对照组的63.89％,差异均有统计学意义（P＜0.05）,40 mg/L多西环素组G0-G1期角膜肌成纤维细胞率接近阳性对照组；10、20、40、60、80 mg/L多西环素作用48 h,G0-G1期角膜肌成纤维细胞率分别为82.78％、86.15％、88.23％、89.57％、93.00％,明显高于阴性对照组的70.17％,差异均有统计学意义（P＜0.01）,而40 mg/L多西环素组G0-G1期角膜肌成纤维细胞百分数接近阳性对照组.结论 在10 ～ 80 mg/L质量浓度时,多西环素以剂量-时间效应依赖的方式抑制体外培养牛角膜肌成纤维细胞的增生,40 mg/L多西环素与120 mg/L地塞米松具有相当的作用效果.

深板层角膜内皮层移植治疗角膜内皮损伤的实验研究

目的:探讨深板层角膜内皮层移植在兔角膜内皮损伤模型的应用效果。方法:选择新西兰白兔24只,制作兔角膜内皮损伤模型第2d随机分为两组:实验组进行深板层角膜内皮层移植术组,对照组不予处理。分别于术后1,2,3,7,14d;1mo观察眼压、前房反应、并发症情况,术后1mo每组处死12只兔子,摘除眼球,12眼(两组各6眼)作病理切片检查,HE染色观察炎症细胞情况;另12眼(两组各6眼)用α-SMAWholemount染色法观察兔角膜内皮细胞瘢痕和肌成纤维细胞情况并进行细胞计数。结果:实验组角膜术后一直维持透明,对照组在术后5d明显变混浊,眼压、前房反应和并发症在两组间差异无显著性(P>0.05)。术后1mo两组实验兔在单位面积(500μm2)肌成纤维细胞数和炎症细胞数均有显著性差异(t=5.716,6.991;P<0.05)。结论:深板层角膜内皮层移植应用于兔角膜内皮损伤模型中炎症反应小,前房反应轻,能保持角膜透明,且并发症少。

多西环素对角膜瘢痕形成的影响

目的:研究多西环素对角膜瘢痕形成的影响。方法:(1)体外实验:收集人眼角膜基质分离并培养,使用免疫荧光双染鉴定所提取到的细胞为人角膜细胞。多西环素组在传代培养后加入重组人转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人角膜细胞分化成角膜肌成纤维细胞,培养2 h后加入浓度为20 ng/mL的多西环素溶液,另设不加入任何药物的对照组和只加入TGF-β1的模型组,放入培养箱继续培养48 h。蛋白免疫印迹(Western blotting)检测CollagenⅠ和Fibronectin蛋白表达;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测CollagenⅠ和Fibronectin mRNA相对表达量。(2)体内实验:采用36只雌性SD大鼠构建角膜碱烧伤模型,随机分为对照组和多西环素组,每组18只。采用体视显微镜观察大鼠角膜恢复情况并在第3、第7、第14天进行角膜混浊度评分,角膜取材后做HE染色观察大鼠角膜组织结构变化。结果:模型组细胞Fibronectin、CollagenⅠmRNA和蛋白相对表达量均较对照组升高(均P<0.05),多西环素组细胞Fibronectin、CollagenⅠmRNA和蛋白相对表达量均较模型组降低(均P<0.05)。与对照组相比,大鼠角膜碱烧伤后第7、第14天,多西环素组大鼠角膜混浊度评分更低(P<0.05);HE染色图片,各个时间点多西环素组大鼠角膜基质结构更规整,第7天多西环素组上皮修复更佳、炎症细胞浸润更少。结论:多西环素可以抑制人角膜细胞分化为肌成纤维细胞,促进大鼠角膜碱烧伤后角膜愈合,减轻角膜瘢痕。

MicroRNA-29a-3p调控转化生长因子β1诱导的人角膜基质细胞的肌成纤维细胞转化

目的探讨MicroRNA-29a-3p对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人角膜基质细胞肌成纤维细胞转化的影响。方法本实验选用培养至2~4代的人角膜基质细胞,分别设置对照组、TGF-β1组、miR-29a过表达对照+TGF-β1组、miR-29a过表达+TGF-β1组、miR-29a抑制表达对照+TGF-β1组及miR-29a抑制表达+TGF-β1组。采用TGF-β1体外诱导的人角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化,细胞饥饿过夜之后,在无血清的条件下转染miR-29a 24 h;然后以浓度5 ng/mL加入TGF-β1,无血清培养48 h。采用CCK-8法检测细胞活力,采用细胞总RNA提取法提取细胞总RNA,逆转录成cDNA后采用实时荧光定量PCR法检测目的相应指标的表达情况,Western Blot法检测相应蛋白的表达。结果人角膜基质细胞呈多角形,树突状,排列规则。按实验设计处理完细胞之后,各组细胞活性差异无统计学意义(P>0.05),转染效果良好。与对照组比较,TGF-β1组平滑肌肌动蛋白α(αSMA)的mRNA表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.001);与miR-29a过表达对照+TGF-β1组比较,miR-29a过表达+TGF-β1组αSMA mRNA表达有明显下降,差异有统计学意义(P=0.001);与miR-29a抑制表达对照+TGF-β1组比较,miR-29a抑制表达+TGF-β1组αSMAmRNA表达有明显上升,差异有统计学意义(P=0.019)。同时,αSMA在蛋白水平的表达结果可得,对照组与TGF-β1组相比,αSMA的相对表达量显著升高,差异有统计学意义(P<0.001);miR-29a过表达+TGF-β1组与miR-29a过表达对照+TGF-β1组相比αSMA的相对表达量明显降低,差异有统计学意义(P=0.007);而该指标在miR-29a抑制表达+TGF-β1组与miR-29a抑制表达对照+TGF-β1组的比较中增高且差异有统计学意义(P=0.034)。结论MicroRNA-29a对TGF-β1诱导的人角膜基质细胞的肌成纤维细胞转化作用是负性的。

白藜芦醇对碱烧伤小鼠角膜纤维化反应的抑制作用

目的探索白藜芦醇(RSV)对碱烧伤小鼠角膜纤维化反应的抑制作用。方法选取SPF级、健康6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠48只,按照随机数字表法分为正常对照组、模型组和RSV组,每组16只。模型组和RSV组小鼠右眼建立角膜碱烧伤模型,左眼不做任何处理。RSV组小鼠用2 g·L^(-1)RSV溶液滴眼,模型组小鼠用相同剂量的羟丙基-β-环糊精溶液滴眼,连续滴眼21 d。正常对照组小鼠不做碱烧伤和滴眼干预。碱烧伤后21 d,裂隙灯显微镜观察各组小鼠角膜混浊情况,对角膜混浊程度进行评分;通过HE染色观察各组小鼠角膜组织结构变化;采用免疫荧光染色观察各组小鼠角膜组织中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅲ型胶原纤维蛋白α1链(COL3A1)的表达;利用Western blot检测各组小鼠角膜组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-SMA、COL3A1蛋白相对表达水平。结果碱烧伤后21 d,RSV组小鼠角膜混浊评分为(2.25±0.89)分,明显低于模型组(3.25±0.71)分,差异有统计学意义(P=0.026)。HE染色结果显示,模型组小鼠角膜基质中细胞增多,给予RSV干预后细胞相对减少。免疫荧光染色结果显示,RSV组小鼠角膜组织中α-SMA和COL3A1的表达均弱于模型组。Western blot检测结果显示,RSV组小鼠角膜组织中TGF-β1(0.60±0.17)、α-SMA(0.27±0.05)、COL3A1(0.49±0.21)蛋白相对表达水平均显著低于模型组TGF-β1(1.48±0.50)、α-SMA(0.55±0.18)、COL3A1(1.32±0.87),差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论在小鼠角膜碱烧伤中,RSV可以有效抑制角膜组织中TGF-β1的表达及肌成纤维细胞的活化,减少COL3A1沉积,从而抑制角膜的纤维化反应,进而减轻角膜混浊程度。