平欧杂种榛实时荧光定量PCR内参基因的筛选与体系建立

【目的】构建中国榛属植物主要栽培种平欧杂种榛实时荧光定量PCR内参基因的筛选体系,并筛选稳定的内参基因,为榛属植物的基因表达分析提供内参基因,进而为其植物资源利用和创新育种研究提供理论基础。【方法】利用课题组前期对平欧杂种榛不同亲和性授粉、授粉后不同时间的雌蕊转录组测序数据,结合相关文献搜索,共选取12个候选内参基因;以平欧杂种榛主栽品种‘达维’的盛花期雌蕊、未伸长期雄花序、幼嫩叶片、花粉、一年生枝形成层、嫩茎、根尖、根蘖等8个不同组织器官为研究材料;通过反转录PCR初筛,实时荧光定量PCR检测表达量,并利用ge Norm、Norm Finder、Best Keeper、Delta Ct程序和Ref Finder在线网站评价内参基因的稳定性。【结果】反转录PCR初筛表明,12个候选内参基因引物的特异性良好,Cha STP5和Cha TF在不同组织器官材料中表达存在明显差异,其余候选内参基因在8个组织中均有表达。实时荧光定量PCR的表达谱分析表明,Ch18S r RNA的表达量最高,Cha STP5表达量最低,其余10个候选内参基因均为中等表达量;Cha STP5和Cha TF的稳定性最差,其余10个候选内参基因的稳定性处于中等水平。ge Norm、Norm Finder、Best Keeper和Delta Ct的结果表明,Cha Actin均排名第一,为最稳定的内参基因,Ch18S r RNA的排名均在前五,而其他候选内参基因在不同程序分析结果中的排名存在差异。稳定性综合分析表明,Cha Actin和Ch18S r RNA的稳定性良好,即在8个不同组织器官中表达量均一且在4个稳定性分析程序中均排名靠前,适合作为内参基因;ge Norm程序的变异系数分析则表明,选取6个内参基因便可对RT-q PCR的数据进行精准的标准化处理;相关性分析表明,4个程序均在0.01水平上呈现显著的相关性,Norm Finder和Delta Ct程序的相关性最高,Delta Ct与Best Keeper的相关性最低。【结论】建立了平欧杂种榛实时荧光定量PCR内参基因的筛选体系:以反转录PCR初筛引物,荧光定量PCR分析引物特性及基因表达,4个程序单独评价引物稳定性,Ref Finder综合分析选出最适稳定内参基因,并选出榛属植物8个不同组织器官中最为稳定的2个内参基因Cha Actin和Ch18S r RNA。

平欧杂交榛CBF/DREB1转录因子ChaCBF1基因的克隆与功能分析

为研究榛属植物的抗寒分子机理,以平欧杂交榛‘达维’为试材,采用同源克隆和RT-PCR技术克隆获得一个CBF/DREB1转录因子基因Cha CBF1,Gen Bank登录号为KT757373。该基因开放阅读框为666 bp,编码221个氨基酸,其相对分子质量为26.4 k Da,理论等电点为5.88。氨基酸序列比对结果显示Cha CBF1含有一个高度保守的AP2/ERF结构域,以及PKK/RPAGRx KFx ETRHP和DSAWR等CBF蛋白特征序列。系统进化树分析发现Cha CBF1与垂枝桦Bp CBF3蛋白的亲缘关系最近。通过基因枪轰击法使重组质粒p1302-Cha CBF1-GFP在洋葱表皮细胞瞬时表达,亚细胞定位结果显示Cha CBF1定位于洋葱表皮细胞的细胞核。通过实时荧光定量PCR检测了Cha CBF1基因在多种非生物胁迫下的表达模式,结果表明Cha CBF1基因的表达能够持续而强烈地响应低温信号,同时其表达也受干旱、高盐和ABA的诱导。通过农杆菌介导的花序侵染法将重组质粒p1301bar-Cha CBF1转化野生型拟南芥,对Cha CBF1基因的功能进行了研究。结果表明:过表达Cha CBF1的转基因拟南芥增强了对冷冻胁迫的耐受性,其成活率显著高于对照植株;转基因植株在正常和低温条件下能够显著上调冷响应基因RD29A和COR47的表达,并积累较高水平的游离脯氨酸和可溶性糖等渗透调节物质,从而提高其抗寒能力。研究结果表明,转录因子Cha CBF1基因在杂交榛冷响应途径中发挥重要作用。

多酚对平欧榛仁分离蛋白凝胶特性及体外消化特性的影响

多酚与蛋白质结合能够影响蛋白质凝胶特性,进而影响食品的质地。以平欧榛仁分离蛋白(hazelnut protein isolate,HPI)为原料,将茶多酚(tea polyphenol,TP)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)、没食子酸(gallic acid,GA)等3种多酚分别与HPI结合,探讨3种多酚对HPI结构性质、凝胶特性、凝胶结构性质、蛋白质消化率及消化产物抗氧化性的影响。结果表明,3种多酚均可促进HPI结构展开,通过疏水相互作用和氢键与HPI结合。TP、EGCG、GA的加入使HPI凝胶硬度分别提高了47.77%、59.87%、10.76%(P<0.05);凝胶持水性分别提高了37.20%、39.74%、28.17%(P<0.05)。与HPI凝胶、HPI-TP凝胶、HPI-GA凝胶相比,扫描电镜观察结果显示,HPI-EGCG凝胶微观结构更为致密;凝胶流变学特性分析结果显示,HPI-EGCG储能模量更高;傅里叶变换红外光谱显示,HPI-EGCG凝胶氢键作用更强、β-折叠含量更高,凝胶硬度和持水性更好。凝胶分子间作用力分析结果显示,氢键和二硫键是维持HPI-TP凝胶和HPI-EGCG凝胶的主要作用力,疏水相互作用和二硫键是维持HPI-GA凝胶的主要作用力。与HPI凝胶、HPI-TP凝胶、HPI-GA凝胶相比,HPI-EGCG凝胶中游离巯基含量更低、二硫键含量更高,凝胶结构更稳定。经体外消化后,TP、EGCG使HPI凝胶蛋白质消化率降低,GA使HPI凝胶蛋白质消化率增加(P<0.05)。4种凝胶中,HPI-EGCG凝胶消化产物抗氧化性更强(P<0.05)。多酚能够有效改善HPI的凝胶特性并保留其抗氧化性,其中HPI-EGCG凝胶具有较佳的凝胶特性和消化产物抗氧化性。希望研究结果可为新型平欧榛仁分离蛋白凝胶产品的开发和利用提供理论依据。

平欧杂种榛坚果性状的加工性能分析与综合评价

对现有主要平欧杂种榛品系的加工性能进行分析和综合评价,为加工专用型品种的选育提供基础数据和理论依据。获得了32个品系的10项与加工性能相关的坚果性状数据,采用隶属函数法进行数据转化,通过因子分析法对其进行分析和综合评价。结果表明:坚果性状中影响加工性能的关键因子依次为:坚果的加工因子、大小因子和形状因子;根据加工性能的综合分值,筛选出84-69、85-28、82-8、84-545和84-36等品系的坚果加工性能较优。可根据带壳烤制型和仁用加工型两种加工方向的具体要求,结合其田间生长表现、种仁营养和风味,进一步筛选出加工专用型品种。

不同产地杂交榛果实品质比较分析

以辽宁沈阳和新疆伊犁4种平欧杂交榛成熟坚果为材料,对其外观经济性状及果仁的营养品质进行测定比较。结果表明:产自伊犁的榛果,其单果质量和出仁率明显高于沈阳榛果,两产地均以辽榛7号单果质量最大,均在2.5g以上,而出仁率仅为35%左右,伊犁产地出仁率最高的是平欧15号,达48.60%,沈阳则是玉坠出仁率最高为44.66%。沈阳与伊犁榛果相比,前者榛仁中蛋白质、油酸含量较高,后者榛仁中亚油酸含量较高,两产地榛仁中棕榈酸、硬脂酸、亚麻酸含量差异不大。辽榛7号在两产地的蛋白质含量均最高,达维、玉坠较低。引种伊犁后,榛果的还原糖含量有所增高,以达维增幅最大为45.8%。伊犁榛果的VE和K含量分别比沈阳的高15.5%和3.06%,而Ca和P的含量比沈阳榛果低16.68%和24.33%。

应用FISH-AFLP技术分析平欧杂种榛主栽品种的遗传关系

【目的】建立平欧杂种榛FISH-AFLP技术体系,并应用该技术分析平欧杂种榛主栽品种的遗传关系。【方法】以达维等10个主栽品种为试材,经DNA提取、PstⅠ/MseⅠ双酶切,进行FISH-AFLP反应,数据转换为"0—1"矩阵后,使用NTSYS pc 2.11F和Popgene 1.32软件进行数据分析并作图。【结果】从64对引物中,筛选出15对多态性强的PstⅠ/MseⅠ引物,共获得1 739条谱带,引物平均多态带比率97.94%;平欧杂种榛主栽品种的相似性系数为0.7556—0.8543,当阈值为0.8398时,可分成4个AFLP群,其中,玉坠(84-310)、辽榛4号(85-41)和平欧69号(84-69)单独为1群,其他品种为1群;平欧杂种榛主栽品种的有效等位基因数、基因多样度、Shannon信息指数分别为1.3921、0.2482和0.3957,具有较高的遗传多样性;研究获得的特征条带可用于平欧杂种榛主栽品种的快速鉴别。【结论】由于平欧杂种榛的实生选优群体是多亲本组合的混合后代,因此,该群体是一个具有高度遗传多样性的群体,主栽品种间存在复杂的亲缘关系;研究构建的FISH-AFLP技术流程、筛选得到的引物以及分析得到的各项遗传参数,可为其他榛属植物的相关研究提供参考。

平榛与龙榛的远缘杂交F_1代田间评比试验初报

在平榛与龙榛的远缘杂交育种中F1代田间评比试验是杂交榛子新品种选育的关键环节之一。为了给今后杂交榛子新品种的选育奠定基础,对平榛Corylus heterophylla Fisch.×龙榛C.heterophylla×C.avellana杂交F1代进行了田间评比试验,并对其各项生长性状指标进行了测定与分析。测定结果表明:在平榛C.heterophylla×龙榛C.heterophylla×C.avellana杂交F1代良种幼树各项生长性状指标值中,只有当年高有差异,其余各项指标值之间的差异则不显著,这说明,当年定植后苗木尚处于缓苗期,其生长缓慢,故各项测定值之间的差异不大;龙榛C.heterophylla×C.avellana×平榛C.heterophylla杂交F1代良种幼树各项生长性状指标的测定值,各杂交组合间存在着明显的个体差异。评比试验结果还表明,今后依据对杂交F1代个体在抗寒、结实等方面表现出的优异特性的评比结果,可望选育出优质、高抗、丰产的杂交榛子新品种。

杂交榛和欧洲榛扦插生根关键技术

以山东省经济林研究所试验地5年生杂交榛Corylus heterophylla×C.avellana‘85-134’和欧洲榛C.avellan‘Barcelona’为对象,于2007年3-7月在山东农业大学温室进行扦插试验,对影响杂交榛‘85-134’和欧洲榛‘Barcelona’扦插生根的关键技术进行了系统研究。结果表明:①杂交榛‘85-134’和欧洲榛‘Barcelona’均适于进行嫩枝扦插,以7月初为最佳扦插时期,杂交榛‘85-134’和欧洲榛‘Barcelona’生根率分别达到71.1%和81.1%,插穗平均根数分别达到10.3根和11.7根,都极显著的优于其他3个时期。②在山东泰安地区,杂交榛‘85-134’和欧洲榛‘Barcelona’基部萌条生根率分别为43.3%和45.6%,生根效果不及树冠枝条。③植物生长调节物质对杂交榛‘85-134’和欧洲榛扦插生根均有一定促进作用,其中以100 mg·L-1吲哚丁酸(IBA)溶液浸泡2 h促根效果最佳。④以珍珠岩∶蛭石=2∶1(体积比)为扦插基质,其液气固三相比最理想,有利于插穗生根。

平欧杂种榛主栽品种需冷量、需热量研究

[目的]揭示平欧杂种榛主栽品种的需冷量和需热量,更好地指导生产做好区域化栽培。[方法]本研究以16个平欧杂种榛主栽品种的1年生枝条为试材,以野生平榛1年生枝条为对照,通过水培观察的方法,首次对平欧杂种榛的雌、雄花序和叶芽进行需冷量和需热量研究。[结果]表明:平欧杂种榛不同器官的需冷量由低到高依次为雄花序336 1 176 h、雌花序504 1 344 h、叶芽672 1 512 h;需热量由低到高依次为雄花序687.0 998.5GDH℃、雌花序998.5 3 496.1 GDH℃、叶芽2 546.5 4 180.3 GDH℃;不同品种、器官在刚满足最低蓄冷要求时需热量最高,随着蓄冷时间的延长,需热量逐渐减少。[结论]首次报道了平欧杂种榛主栽品种雄、雌花序和叶芽的需冷量和需热量数据,其中,达维、平欧48号等品种花器官需冷量较低,辽榛2号、平欧545号等品种花器官需冷量较高;玉坠、平欧69号等品种花器官需热量较低,辽榛1号、辽榛4号等品种花器官需热量较高,上述研究丰富了榛属植物开花和休眠解除方面的数据,可为平欧杂种榛的引种和栽培提供参考。

基于测交系设计的平欧杂种榛果实性状的遗传分析

以4个新疆主栽平欧杂种榛品种(系)达维、辽榛7号、玉坠、平欧15号作母本,平欧杂种榛1-25、84-102、85-57、84-5、B-21作父本,按照测交系遗传交配设计,进行控制授粉,对杂交所得果实性状进行配合力分析,旨在阐明平欧杂种榛授粉树配置的可行性及双亲对其果实性状的影响。方差分析结果表明:在亲本亲和的基础上,4×5测交系遗传交配设计中不同杂交组合间的结实率差异不显著;杂交所得果实性状在不同杂交组合间的差异均极显著,重复区组间的差异不显著。配合力效应分析结果表明:亲本的一般配合力效应占较大的方差分量,母本的一般配合力效应达到极显著程度,而特殊配合力效应及父本效应较小,平欧杂种榛种内杂交果实性状以其加性效应占优势且受母本的影响比较大。平欧15号凭借其优良的果实性状和较好的果实外形品相,更适合作为主要品种在新疆推广。父本84-5凭借其果仁三径均值、果仁质量、出仁率、果腔系数的一般配合力最大且为正向效应,果壳厚为负向效应,有利于果实的经济效应,适合作为授粉品种。

榛新品种‘晋榛1号’的选育

‘晋榛1号’是由‘平欧28号’实生播种选育而成的抗寒性较强的平欧杂种榛新品种。雄花发育良好,果实近圆形,果面光洁,黄白色,果壳较薄,为1.48 mm,果个大,平均单果质量2.6 g,最大单果质量3.4 g,果仁饱满,味香甜;出仁率高达42%,脂肪含量(ω,后同)56.9%,蛋白质含量18.4%,含碳水化合物8.7%,品质上乘。果实生育期95~100 d,在山西太谷地区果实成熟期为8月下旬;花序花朵数4~15朵,每朵花有2枚柱头,萌芽率为44.6%,成枝力为3.6。抗寒性强,比母本树的雄花序多,开花物候期晚有利于避开晚霜危害。果实在5~18℃通风干燥的室内可存放1 a(年)。适宜山西忻州以南地区栽植发展,其他地区推广需进一步开展区试。第3年开始结果,第5年达初盛果期,每666.7 m2产量超过145.7 kg,第7年达盛果期,每666.7 m2产量超过224.7 kg,丰产性强。

河北省平泉县平欧杂交榛越冬性研究

以14个平欧杂交榛品种(系)为试材,开展了越冬保存调查,统计其在河北平泉地区的越冬保存率以及抽条指数。越冬保存调查结果显示,14个品种(系)中达维的越冬保存率最高,达到82.63%,辽榛1号的抽条指数最低,为0.717 6。分别对越冬保存率和抽条指数进行聚类分析,结果表明平均越冬保存率最高的一类为辽榛7号、达维、辽榛3号和84-72,较高的一类为84-545、平顶黄、辽榛2号和13-21;平均抽条指数最低的一类为13-21、平顶黄和辽榛1号,较低的一类为辽榛3号,辽榛2号和85-127。以3个平欧杂交榛品种(系)为试材,设置了不同厚度蘑菇渣覆盖的对比试验,并探讨了不同厚度覆盖下的土壤水分和温度与平欧杂交榛的越冬保存率和抽条指数的相关性。覆盖试验表明,蘑菇渣覆盖有利于提高平欧杂交榛的越冬保存率和抗抽条能力,平欧杂交榛的越冬性与1、2月份地下30 cm水分及4个月地下30 cm水分总和呈显著正相关,由此可见,蘑菇渣覆盖是通过提高土壤水分和温度从而提高了杂交榛的越冬能力。

中国榛属植物资源培育与利用研究(Ⅲ)--育种、育苗与栽培

优良种质是榛子产业发展的基础,传统的平榛生产已从野生采摘、粗放经营向采用优良类型采种圃的种子进行育苗、标准化垦复管理的方向发展。平欧杂种榛的育种成功,结束了我国没有栽培种的历史,开启了我国榛子产业发展的新时代。目前,已经基本明确了平欧杂种榛主要品种的特性及其适生区域。生产上普遍采用的是绿枝直立压条育苗方法,嫩枝扦插和组培育苗技术也取得了成功并开始应用于生产。平欧杂种榛‘平欧28号’、‘平欧33号’、‘平欧62号’、‘达维’等品种具有极强的抗抽条能力,‘平欧21号’、‘平欧33号’、‘平欧545号’、‘辽榛4号’、‘平欧237号’、‘辽榛8号’等品种具有很强的耐盐碱能力。榛树具有自交不亲和现象,但目前尚没有专用授粉品种,建立榛子园需要选配几个既能亲和、又能花期相遇的不同品种进行相互授粉。榛树栽培施肥方面的研究较少,今后应结合土壤养分含量、树体营养状况、生理需肥时期、树体负载量等多因素制定施肥方案。树形选择应综合考虑栽植区域的气候、土地类型、管理方式等特点选用单干树型或丛状树形。平欧杂种榛以1年生中长枝结果为主,修剪时要依据这些特性制定技术方案。有害生物防治是榛子生产的主要问题,本着预防为主的原则,加强有害生物危害规律的研究,大力推行生物防治。

喷施叶面肥对平欧杂种榛‘新榛1号’嫩枝扦插的影响

研究不同配方叶面肥对平欧杂种榛嫩枝扦插效果的影响,为提高平欧杂种榛扦插苗成活率及苗木质量提供理论依据。在测定7项扦插效果指标的基础上,采用隶属函数法进行数据标准化,对所测指标进行基于主成分分析的综合评价。结果表明:不同配方的扦插效果指标变异程度各异,其中萌芽率、新稍平均长度和抽梢率差异较大,均达到50%以上,根长、发根数、根粗和生根率差异较小;主成分分析提取出2个特征根>1的主成分,累计方差贡献率达91.44%,能够全面反映扦插效果指标的信息;配方2综合得分最高,抽梢率最高且新稍平均长度最长;配方3次之,根系较长且较为粗壮,同时生根率达到最高;配方1得分最低。综合来看,配方2叶面肥在兼顾根系质量的同时对新梢生长促进最明显,喷施效果最佳。

平欧榛子花序及花器官发育

在扫描电镜下观察了平欧榛子花序和花的形态发生过程.平欧榛子雌花序由多个小聚伞花序螺旋状排列组成;每个小花序原基分化出1枚初级苞片和一团小花序原基分生组织,由小花序原基分生组织分化形成2个花原基;每个花原基分化出2个心皮原基,形成二心皮雌蕊;雌蕊基部有2层花被原基,内层花被原基环状,发生于心皮原基,外层花被发生于花原基近轴面和远轴面,且不均等分化,外层花被发生早于内层花被.雄花序为柔荑状,由多个小聚伞花序螺旋状排列组成.每个小花序原基分化出1枚初级苞片和一团小花序原基分生组织,由小花序原基分生组织分化出2枚次级苞片和4个花原基,由花原基直接发育为4个雄蕊原基,形成4枚雄蕊,花丝纵裂至基部.研究认为平欧榛子结果率低,空粒率高的主要原因是花粉粒萌发率低,另外,寒冷地区的倒春寒气候会造成花柱受到冻害,影响传粉受精.

晋西北地区平欧杂种榛引种适应性研究

将达维、玉坠、辽榛3号、辽榛7号引种至山西北部的怀仁县金沙滩镇和山西西部的方山县,通过对其物候期、生长特性、开花结果特性和抗逆性进行观测,研究4个品种在当地的适应性。结果表明:4个引进品种完全适应当地的环境条件,可以完整地完成生长周期。

扦插时期和基质种类对榛子嫩枝扦插生根的影响

试验以5 a树龄杂交榛(85-134)和欧榛(巴塞罗纳)当年生嫩枝为试材。结果表明:(1)杂交榛(85-134)和欧榛(巴塞罗纳)嫩枝扦插均可生根,以欧榛生根效果略好;(2)杂交榛(85-134)和欧榛(巴塞罗纳)枝条长生长动态呈"慢-快-慢"的"S"型曲线,在供试的三个时期中以枝条长生长速生期结束即7月初扦插效果最佳,两品种的生根率最高,分别达到71.1%和81.1%;(3)以珍珠岩和蛭石(体积比为2∶1)为扦插基质,其气、液、固三相比最理想,最有利于插穗生根。

不同基质对沙地平欧杂种榛苗木生根的影响

以平欧杂种榛达维(84-254)为试料,研究不同基质对生根率、生根数量、生根粗度、生根长度以及基质温度对其生根的影响。结果显示:当基质是锯末+草炭时,达维的生根率、生根数量和生根长度最大,分别达到了91.68%、21条、23.42cm;当基质为锯末+土时,达维的生根粗度最大,达到了0.223cm。

不同环束高度对龙榛育苗的影响

[目的]探讨不同环束高度对龙榛育苗的影响,为培育优质壮苗提供技术支撑。[方法]以龙榛5个品种为试验材料,开展不同环束高度对根蘖育苗影响的研究。[结果]不同环束高度对龙榛育苗的生根率、合格苗率及苗木生长有着明显影响,以环束高度为地面以上2 cm处理时根系和苗木生长指标最优;不同龙榛品种对环束高度处理也表现出差异,以龙榛4号表现最优。[结论]不同龙榛品种育苗适宜的环束高度为地面以上2 cm处。

平欧杂种榛配方施肥研究

以平欧杂种榛"达维"为试材,以园地传统施肥量为对照,对配方肥中氮、磷、钾单因素施肥量进行了试验。通过测定试验树单株产量、果实百粒重、百叶质量、叶面积等指标,发现配方肥中氮、磷、钾含量对试验树果实百粒重、百叶质量没有显著影响,但对单株产量、叶面积有显著影响。单株施氮量为300 g时,平均单株产量最高;单株施磷量为100 g时,平均单株产量最高;单株施钾量为100 g时,平均单株产量最高、平均叶面积最大。