利用CRISPRi技术构建乙醛酸生物合成Corynebacterium glutamicum工程菌

以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)为出发菌株,敲除其支流代谢关键酶乳酸脱氢酶合成基因lldh,建立规律间隔成簇短回文重复序列干扰(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference,CRISPRi)调控体系,并利用该体系下调支流代谢中的关键酶异柠檬酸脱氢酶合成基因icd和苹果酸合成酶合成基因ms的表达强度,同时过表达异柠檬酸裂合酶合成基因icl,强化乙醛酸合成的通路。通过48 h连续监测工程菌和野生菌生长状况,并检测发酵终产物。结果显示:工程菌生长几乎不受影响,发酵液中乙醛酸质量浓度达到5 mg/mL,实现了乙醛酸的积累,为谷氨酸棒状杆菌工业生产乙醛研究提供一定的参考。

基于谷氨酸棒状杆菌的茶氨酸生物合成工程菌构建

将茶树谷氨酰胺合成酶基因(Cs GS1;3,GenBank登录号AB117934.1)克隆,并与穿梭表达载体pZ8-1连接,将重组质粒通过电转法转到谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032感受态细胞,构建了谷氨酸棒状杆菌重组菌株Corynebacterium glutamicum ATCC 13022/p Z8-Cs GS1;3。再将成功构建的该重组菌株经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在30℃下诱导4 h后,进行体外酶活反应。反应产物用薄层层析(TLC)检测发现有产物茶氨酸生成,经液相色谱三重四级杆串联色谱仪(LC-MS)进一步检测确定其合成产物为茶氨酸。

谷氨酸棒状杆菌新型诱导启动子的研究

以丰富和完善谷氨酸棒状杆菌的表达元件、筛选适合工业化应用的新型诱导启动子为研究目标,借助绿色荧光蛋白GFP为报告基因,构建启动子筛选工具质粒,在谷氨酸棒杆菌中表达,筛选出三种高效表达的诱导启动子.通过检测绿色荧光蛋白表达强度可知:丙酸启动子诱导表达强度最大,葡萄糖酸启动子次之,蔗糖启动子较弱;丙酸启动子最适诱导浓度为60 ug/m L、葡萄糖酸启动子2 mg/m L、蔗糖启动子2 mg/m L,表达强度比无诱导对照组分别增加4.39、3.86、2.74倍.