猪链球菌反应调节因子CovR单克隆抗体的制备与鉴定

目的CovR是一个全局性反应调控因子,对猪链球菌的致病性具有重要调控作用。文中制备抗2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype2,S.suis2)反应调节因子CovR蛋白单克隆抗体(mAb),以便对CovR的调控机制进行系统研究。方法以基因工程重组CovR蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选可稳定分泌抗CovR mAb的杂交瘤细胞株。通过间接ELISA法和Western blot鉴定抗CovR mAb的特异性后,制备小鼠腹水并测定单抗腹水的抗体效价。单抗分型ELISA鉴定抗CovR单克隆抗体IgG亚类。结果获得2株能稳定分泌抗CovR mAb的的杂交瘤细胞株1A4和4D7,其培养上清抗体效价分别为1∶800、1∶1600,其相应单抗腹水的抗体效价分别为1∶819200、1∶1638400。mAb 1A4和4D7IgG亚类分别为IgG2b、IgGl。结论成功制备了抗CovR mAb,为进一步研究CovR的调控机制奠定了基础。

猪链球菌2型中国强毒株CovR重组蛋白及其抗体的制备

目的通过构建pET32a-covR原核表达质粒,表达并提纯CovR重组蛋白,制备其多克隆抗体。方法采用PCR法,从四川资阳病人分离株05ZYH33基因组扩增CovR的编码基因covR,构建重组表达质粒pET32a-covR,转化E.coliBL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE鉴定后,His亲和层析柱纯化CovR重组蛋白;免疫新西兰兔制备特异性抗体,Western blot检测兔多抗血清的特异性,间接ELISA检测其滴度。结果covR基因在原核细胞中得到高效表达,重组蛋白免疫新西兰兔后血清效价高达1∶204800,且重组蛋白能够与之发生特异性的反应。结论成功构建了表达载体pET32a-covR,可在E.coliBL21中高效表达,制备了特异性抗体,为进一步研究CovR的调控机理奠定了基础。

染色质免疫共沉淀法对猪链球菌反应调控因子CovR靶基因的筛选

目的猪链球菌CovR是具有全局调控作用的负反应调控因子。文章采用染色质免疫共沉淀(chromatin immu-noprecipitation,ChIP)方法筛选转录调控因子CovR的靶基因,为进一步开展CovR调控机理研究提供条件。方法利用甲醛固定猪链球菌2型05ZYH33菌株活细胞,超声波破碎法将DNA随机断裂成100～500bp大小不同的片段,再利用CovR特异性单抗免疫沉淀该蛋白质-DNA片段解交联并分离纯化DNA。针对8个潜在的靶标基因启动子区设计引物,分别用设计的引物对免疫共沉淀的DNA样品进行PCR扩增,验证CovR与DNA的结合。结果最佳ChIP实验条件为1%甲醛交联DNA与蛋白质的复合物;功率80 W、工作10 s、间隔30 s、超声40次破碎该复合物,可得到100～500 bp大小不同的片段用于后续实验。PCR结果显示SSU1668基因和SSU1732基因启动子区扩增出阳性条带,另外6种基因的启动子区未扩增出阳性条带。结论 CovR抗体免疫沉淀得到的DNA片段中含有SSU1668基因和SSU1732基因启动子区,表明SSU1668基因和SSU1732基因是CovR的靶基因。

2型猪链球菌中国强毒株及其covR基因突变株的蛋白质组学研究

目的通过比较2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33及其covR基因突变株△covR蛋白表达谱差异,质谱鉴定差异表达蛋白,分析CovR在蛋白表达调控中的作用。方法首先将05ZYH33和△covR在THB培养基中培养至对数期,然后裂解细菌制备蛋白样品。第一向等电聚焦电泳在pH3～10的IPG胶条上完成后进行SDS-PAGE电泳,电泳胶经扫描分析后选取蛋白点进行质谱鉴定。结果 05ZYH33和△covR全菌蛋白裂解液经二维电泳分别得到559和491个蛋白点,经比对发现两菌株蛋白表达量差异3倍以上蛋白点40个,经质谱鉴定出15个蛋白,主要涉及细胞代谢的酶类如谷氨酸脱氢酶、腺苷酸激酶、PTS系统成分等,以及分子伴侣蛋白如GroEL和Dnak等;电泳分离得到△covR特异蛋白点124个,质谱鉴定出15个,主要为参与细胞糖代谢过程中的酶,如磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙酮酸激酶等;质谱鉴定05ZYH33特异表达蛋白5个。结论鉴定05ZYH33和△covR差异表达蛋白35个,部分蛋白涉及细菌毒力、宿主细胞粘附、细胞分裂等生命过程,同时蛋白分子伴侣在△covR中的表达变化说明CovR的调控可能发生在蛋白修饰水平,为研究CovR在调控细菌毒力中的作用和分子机制奠定基础。

高毒力A组链球菌致病机制研究进展

A组链球菌(Group A Streptococcus,GAS)常导致咽炎和皮肤感染,也能引起严重侵袭性感染。根据其表面M蛋白编码基因emm可将GAS分为200多型,严重侵袭性感染多由高毒力株引起,以emm1、emm3、emm12、emm28和emm89型常见。研究发现高毒力GAS株中covRS基因突变可导致细菌逃逸固有免疫防御以及侵袭血管;SpeB的表达下调影响GAS侵袭;高毒力株表达的超抗原(Superantigens, SAgs)能够过度激活T细胞,加剧宿主炎症反应;M1蛋白诱导产生的肝素结合蛋白可造成血管渗漏,加速向全身侵袭。总结了近年来在高毒力GAS致病机制方面的研究进展,以期为GAS严重侵袭性感染的预防和治疗提供新的思路。

2型猪链球菌二元信号系统孤儿调控因子CovR磷酸化位点鉴定

目的利用Escherichia coli BL21原核表达系统共表达2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶STK与孤儿调控因子CovR蛋白,通过质谱鉴定CovR蛋白磷酸化位点,探究STK对CovR的磷酸化作用。方法构建CovR蛋白表达载体pCDFDuet-1::covR及pCDFDuet-1::covR/stk,重组表达蛋白分别命名为CovR1与CovR2。通过蛋白磷酸化质谱技术检验CovR2蛋白的关键磷酸化位点。分别构建CovR苏氨酸突变体CovRT、丝氨酸突变体CovRS、酪氨酸突变体CovRY及丝/苏/酪氨酸全突变体CovRA,与STK共表达后分析其磷酸化状态,确定CovR磷酸化靶点。结果在E.coli BL21表达系统中成功表达并纯化CovR1与CovR2蛋白,Western blot分析发现CovR1无磷酸化信号,CovR2可以被磷酸化。进一步对CovR2磷酸化质谱检测发现其第45、148、150、159、168、194、219位苏氨酸,第40、172、215位丝氨酸以及第225位酪氨酸为关键磷酸化位点。对CovRT、CovRS、CovRY及CovRA突变体磷酸化状态检测,结果表明CovR2的丝/苏/酪氨酸均可发生磷酸化。结论在E.coli BL21中共表达STK与CovR可导致CovR丝/苏/酪氨酸磷酸化,通过质谱技术鉴定了CovR的磷酸化位点,提示CovR可能是STK的磷酸化调控靶点。

Cyl及CovR/S对GBS溶血素作用研究进展

B族链球菌(GBS)学名无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,S.agalactiae)可在15%~30%的健康成人胃肠道和(或)生殖道内定植[1]而无任何症状,一定条件下可以侵袭引起疾病,尤其是孕妇、新生儿、老年人及糖尿病等免疫力低下的人群[2]。